劉堃，曾凡鎖，李博，詹亞光

東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

甲基化是普遍存在于真核生物核DNA中的一種修飾途徑[1]，在高等植物中主要發(fā)生在5mCG和5mCNG位點，其中5mCNG又以CAG、CTG和CCG為主[2]。DNA甲基化可通過抑制DNA（轉(zhuǎn)座子）活性來保護(hù)基因組，也可通過引起基因沉默來調(diào)控特定內(nèi)源基因的表達(dá)[3]。Shibukawa等[4]發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化與胡蘿卜胚胎發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子C-LEC1表達(dá)的調(diào)控有關(guān)；夏蘭芹等[5]發(fā)現(xiàn)，抗蟲棉Bt基因表達(dá)量降低與35S啟動子甲基化程度升高有關(guān)；王海海等[6]在對棉花的研究中證實了外源nptⅡ基因表達(dá)量與35S啟動子甲基化程度的負(fù)相關(guān)性。由此可見，DNA甲基化在植物基因組防御、調(diào)控基因表達(dá)，以及控制植物的生長和發(fā)育中起重要作用[7-8]，對植物本身有著積極的意義，對外源基因的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用。木本植物相對于一年生草本植物，具有生長發(fā)育周期長、基因組龐大等特點。越來越多的研究也表明，樹木無性和有性繁殖過程中伴隨著廣泛的表觀遺傳變異[9-10]，然而關(guān)于甲基化在木本植物發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制及與外源基因表達(dá)的關(guān)系還不明確。因此，對樹木生長發(fā)育過程中不同時間（如展葉初期、旺盛生長期、生長停滯及休眠期等）DNA甲基化水平和模式變化的研究，對于揭示樹木生長發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變的表觀調(diào)控機(jī)制十分必要。

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation-sensitive amplified polymorphism，MSAP）是 Reyna-López等[11]在對真菌的研究中首次提出的使甲基化差異可視化的一種研究手段，是在擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）基礎(chǔ)上建立起來的一種新技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于擬南芥[12]、玉米[13]、橡膠[14]等植物的研究中。其原理是，用對甲基化敏感程度不同的2個同裂酶HpaⅡ和MspⅠ（識別5'-CCGG位點）分別與EcoRⅠ組合后對DNA進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生長度不等的片段，然后在酶切片段兩端連接接頭，根據(jù)相應(yīng)接頭設(shè)計特異性引物對酶切片段進(jìn)行擴(kuò)增，其他遵循標(biāo)準(zhǔn)AFLP分析，經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分離顯色后對比同一位置2組酶切條帶的有無，即可判斷甲基化與否。

我們以轉(zhuǎn)bgt抗蟲基因的白樺為實驗材料，對其不同月份DNA甲基化水平及外源基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，探索DNA甲基化對植物發(fā)育的影響及其與外源基因表達(dá)的關(guān)系，從而為闡述DNA甲基化的相關(guān)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)bgt抗蟲基因白樺（Betu?la platyphylla Suk.）及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵灾灿诒拘０讟鍙娀N基地，在自然條件下生長，于展葉初期、旺盛生長期及生長停滯期（5～9月）分別取轉(zhuǎn)基因白樺的葉片，液氮冷凍，-80℃保存。工程菌為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，雙元載體系統(tǒng)，其中的質(zhì)粒pYHY（13.9 kb）攜帶抗蟲基因（蜘蛛殺蟲肽基因與Bt基因C肽的嵌合基因，簡稱bgt基因）、nptⅡ基因和gus基因[15]。

1.2 白樺DNA-MSAP體系的建立及引物篩選

采用改良的CTAB法提取基因組DNA[16]。選用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ組合分別對基因組DNA進(jìn)行雙酶切［酶切體系：10×NEB緩沖液 5 μL，DNA 40 μL（不多于 2 μg），HpaⅡ/MspⅠ 1.25 μL，EcoRⅠ 2.5 μL，ddH2O 1.25 μL］，37℃過夜酶切，加入 2 μL RNase（10 μg/mL），37℃消化1 h，除去多余的RNA。取酶切產(chǎn)物5 μL，加入10×T4DNA連接酶緩沖液2.5 μL、EcoRⅠ adapt?er 1 μL、H-M adapter 1 μL、T4DNA連接酶1 μL、ddH2O 14.5 μL，短暫離心，16℃過夜反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系包括連接產(chǎn)物5 μL、引物E00和H-M00（10 μmolo/L）各 1 μL、Taq酶 0.3 μL、10×緩沖液 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 8.7 μL。預(yù)擴(kuò)增程序：94℃ 3 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 90 s進(jìn)行30個循環(huán)，72℃ 7 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對表1中選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行組合，并以梯度PCR擴(kuò)增，篩選合適的引物組合。梯度PCR體系為稀釋至 1/10的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物 2 μL、引物（10 μmol/L）各 1 μL、Taq酶 0.3 μL、10×緩沖液 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 11.7 μL。 反 應(yīng) 程 序 ：94℃ 3 min，以94℃ 30 s、65℃ 30 s（每次循環(huán)降低 0.7℃）、72℃90 s進(jìn)行12個循環(huán)，以 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃90 s進(jìn)行22個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠和6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，選擇條帶較多的引物組合進(jìn)行后續(xù)實驗。

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以75 W恒定功率預(yù)熱1 h。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液以5∶1的比例混合后于95℃變性5 min，立刻置于冰上，冷卻后點樣，75 W恒定功率電泳，待溴酚藍(lán)完全跑出膠板后停止電泳，冷卻10～15 min，銀染顯色。

1.3 甲基化水平測定

按照上述建立的方法對不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片基因組DNA進(jìn)行檢測。在電泳圖譜上2條泳道分別為HpaⅡ/EcoRⅠ組合和MspⅠ/EcoRⅠ組合酶切后所得條帶。根據(jù)泳道內(nèi)條帶的有無將條帶類型分為3種：Ⅰ，二者均有帶，表明該位點沒有甲基化；Ⅱ，前者有帶后者無帶，表示半甲基化位點；Ⅲ，后者有帶而前者無帶，表示全甲基化位點。分別統(tǒng)計同一樣本不同引物組合條件下各類型條帶數(shù)量，有帶記為“1”，無帶記為“0”。半甲基化比率=Ⅱ/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）×100%，全甲基化比率=Ⅲ/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）×100%，甲基化多態(tài)性=（Ⅰ+Ⅱ）/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）×100%，從而對甲基化變化水平進(jìn)行測定。

表1 MSAP分析的接頭和引物序列[17-18]

1.4 轉(zhuǎn)基因白樺外源基因表達(dá)量檢測

轉(zhuǎn)基因白樺葉片總RNA的提取采用緩沖液冰浴-CTAB法[19]。取少量用于瓊脂糖凝膠電泳，其余存放于-80℃冰箱中備用。參考DIG DNA Label?ing and Kit試劑盒說明書方法標(biāo)定bgt基因探針，對不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片中外源基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。Northern雜交采用甲醛變性膠電泳，虹吸法過夜轉(zhuǎn)膜，42℃雜交6～8 h。其他操作參照文獻(xiàn)[20]。

2 結(jié)果

2.1 白樺DNA-MSAP體系的建立

2.1.1 基因組DNA的提取與純化 用改良CTAB方法提取不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片基因組DNA的結(jié)果見圖1，條帶清晰，點樣孔干凈，沒有拖尾現(xiàn)象，純度和量都能滿足后續(xù)實驗。

2.1.2 基因組DNA混合雙酶切 用HpaⅡ和EcoRⅠ、MspⅠ和EcoRⅠ兩種內(nèi)切酶組合對白樺葉片基因組DNA進(jìn)行酶切（圖2）。酶切效果很好，彌散狀的條帶說明酶切徹底，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 白樺基因組DNA提取電泳圖譜

圖2 白樺基因組DNA混合雙酶切電泳圖譜

2.1.3 引物篩選 針對3條H-M引物和10條EcoR引物組合成30對引物組合，分別對預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選擇性梯度PCR擴(kuò)增，結(jié)果不同引物組合所擴(kuò)增出的條帶數(shù)差異顯著，條帶較多，說明擴(kuò)增效果較好。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果（表2）篩選出的7對引物組合為E02/H-M01、E03/H-M01、E09/H-M01、E07/H+M02、E08/H-M02、E08/H-M03、E09/H-M03。

2.1.4 白樺基因組DNA-MSAP體系的確定及聚丙烯酰胺凝膠電泳 用對甲基化敏感程度不同的2種內(nèi)切酶建立了研究白樺基因組甲基化水平變化的DNA-MSAP實驗體系。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，結(jié)果每條泳道條帶清晰可辨，每對引物組合都有大量差異條帶，信號強度可靠（圖3）。因此，該體系可用于白樺基因組DNA甲基化水平差異研究。

2.2 不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片DNA甲基化水平分析

2.2.1 不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片DNA甲基化模式分析 選用7對引物對不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片基因組DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測，每對引物組合都獲得了清晰的條帶。如圖3所示，根據(jù)HpaⅡ?qū)?nèi)部胞嘧啶甲基化（CmCGG）敏感而MspⅠ對外部胞嘧啶甲基化（mCCGG）敏感的特性，酶切后在聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上特定CCGG位點帶型可分為3種模式：Ⅰ，HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ組合均有帶，這種情況在圖譜上最為常見，所占比例為66.82%，表示CCGG位點沒有甲基化；Ⅱ，HpaⅡ/EcoRⅠ組合有帶而MspⅠ/EcoRⅠ組合沒有帶，這種模式占17.99%，表示半甲基化位點；Ⅲ，HpaⅡ/EcoRⅠ組合沒有帶而MspⅠ/EcoRⅠ組合有帶，這種情況表示該位點是全甲基化位點，占全部擴(kuò)增片段的15.19%。在擴(kuò)增獲得的856條條帶中，共包含甲基化位點條帶284個，甲基化比例為33.12%。

2.2.2 不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片DNA甲基化狀態(tài)分析 選用擴(kuò)增條帶較多的7對引物對轉(zhuǎn)基因白樺不同月份葉片基因組DNA甲基化動態(tài)變化狀況進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。在5～9月的5個樣品中檢測到的總擴(kuò)增條帶依次為164、162、181、186和163，其中總甲基化帶數(shù)依次為 36、48、46、77和 77，甲基化多態(tài)性依次為21.95%、29.62%、25.41%、41.39%和47.24%。在不同月份樣品中，Ⅱ、Ⅲ類條帶出現(xiàn)比例相差較大，其中，5～9月葉片DNA半甲基化比例依次為10.37%、19.14%、14.92%、17.20%和28.38%，全甲基化比例依次為11.58%、10.49%、10.50%、24.19%和18.40%。由此可見，葉片在同一年的生長發(fā)育過程中甲基化水平處于動態(tài)變化中，除7月稍有波動外，整體上呈現(xiàn)隨著葉片的衰老逐漸升高的趨勢。

表2 30對引物組合擴(kuò)增結(jié)果

圖3 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

2.3 外源基因在不同月份的表達(dá)差異

用緩沖液冰浴-CTAB法提取轉(zhuǎn)基因白樺葉片總RNA（圖4），條帶清晰，28S條帶亮度明顯高于18S條帶，經(jīng)檢測，RNA質(zhì)量達(dá)到Northern印跡要求。

選取表達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因白樺無性系，應(yīng)用Northern雜交分析葉片中外源基因不同月份的表達(dá)差異。采用紫外分光光度法定量結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳來決定各樣品總RNA的雜交用量，每孔點樣20 μg。結(jié)果顯示（圖5），同一無性系在一年中的5～9月份間，5～7月表達(dá)量最高，8～9月呈下降趨勢，這與蟲害發(fā)生時期同步，因此對抗蟲、保護(hù)植株具有重要作用。同時，對比外源基因表達(dá)情況和甲基化狀態(tài)變化模式可發(fā)現(xiàn)，在基因組DNA甲基化水平相對較低的5月，外源基因的表達(dá)量相對較高，而在甲基化水平較高的8月，外源基因卻處于表達(dá)量相對較低的狀態(tài)。由此可見，外源基因的表達(dá)量與基因組DNA甲基化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)趨勢。

表3 不同月份轉(zhuǎn)基因白樺葉片DNA甲基化帶型統(tǒng)計分析

圖4 轉(zhuǎn)基因白樺總RNA電泳圖譜

圖5 轉(zhuǎn)基因白樺中不同月份bgt基因表達(dá)的Northern雜交圖譜

3 討論

MSAP技術(shù)近年被廣泛用于擬南芥[12]、水稻[21]、棉花[22]和蘋果[23]等植物基因組的胞嘧啶甲基化分析，具有可靠、高效等優(yōu)點。該技術(shù)成敗的關(guān)鍵在于酶切效果，而基因組DNA的質(zhì)量直接影響酶切效果，因此獲得高質(zhì)量的基因組DNA是MSAP技術(shù)分析的關(guān)鍵節(jié)點。白樺葉片中含有大量與DNA性質(zhì)極為相似的多糖，從而影響了基因組DNA的提取，而我們采用緩沖溶液短暫冰浴法將多糖降低到較低水平，可滿足后續(xù)實驗要求。對連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，可實現(xiàn)模板DNA的選擇性純化，增加目標(biāo)DNA片段的數(shù)量，為選擇性擴(kuò)增提供充足的DNA保障。我們在試用的30對引物組合中選出7對條帶多態(tài)性較高的組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，能夠有效反映不同月份葉片基因組DNA甲基化狀態(tài)，這對揭示葉片不同發(fā)育階段表觀遺傳狀態(tài)變化水平具有重要意義。

本研究中平均甲基化位點比例為33.12%，符合前人在植物研究中得到的MSAP對基因組DNA甲基化的檢出率為4.5%～45%的規(guī)律[24-26]，與之前對福松（30%～60%）[10]、蘋果（25%）[23]、杉木（42%～79%）[27]和橡膠（22.9%～33.2%）[28]等木本植物基因組DNA甲基化的檢出率不同，這體現(xiàn)了基因組DNA甲基化修飾水平在不同物種間的差異。受HpaⅡ和MspⅠ識別位點的限制，本研究只反映了部分CG或CCG位點的甲基化狀態(tài)，整個基因組的甲基化水平可能略高于本實驗結(jié)果，但CG和CCG是高等植物中的主要甲基化位點[2]，故CCGG位點甲基化狀態(tài)能夠相對客觀地反映植物基因組甲基化修飾水平。本研究表明轉(zhuǎn)基因白樺成熟葉片DNA甲基化水平顯著升高，這說明在葉片的發(fā)育過程中伴隨著DNA甲基化狀態(tài)的改變，這與Fraga等對福松不同發(fā)育階段甲基化程度的研究結(jié)果相似，幼年的DNA甲基化水平為30%～35%，成熟的為60%[10]。而Baure等在對桃樹研究中發(fā)現(xiàn)幼嫩葉片的DNA甲基化水平為22.4%，成熟葉片為20.7%[29]。可見DNA甲基化水平在不同植物發(fā)育過程中的變化趨勢不同。這些結(jié)果表明DNA甲基化程度變化可能與葉片的發(fā)育過程相關(guān)，但是促使葉片發(fā)育的原因還是葉片發(fā)育的結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。李旭剛等發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)域的甲基化阻斷了外源uidA基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致該基因失活[30]；Duan等的研究表明，CMV啟動子的高度甲基化導(dǎo)致綿羊體細(xì)胞內(nèi)外源fat-1基因的沉默[31]。可見甲基化在對外源基因表達(dá)的調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。我們對白樺外源基因表達(dá)情況的研究表明，在同年5～8月間外源基因的表達(dá)狀態(tài)與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)趨勢。這與夏蘭芹等的研究結(jié)果相似，Bt基因在抗蟲棉生長發(fā)育后期表達(dá)量降低與35S啟動子甲基化程度升高有關(guān)[5]。此外，譚雙香等的研究證明，甲基化是導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞系膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)下調(diào)的主要原因[32]。綜合以上研究結(jié)果可以得出結(jié)論，轉(zhuǎn)基因白樺DNA甲基化水平的升高影響了外源基因的轉(zhuǎn)錄，終致其表達(dá)水平降低。

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