劉紅云，劉麗君，覃彩芹，田思思，李志萍

（1.湖北工程學(xué)院 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感432000；2.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感432000）

酒精性肝細(xì)胞線粒體損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化在酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。線粒體機(jī)能障礙，尤其是線粒體解偶聯(lián)，引起線粒體原動(dòng)力降低，ATP損耗。損害的線粒體影響脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡，生物能運(yùn)行障礙，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，導(dǎo)致脂質(zhì)積聚和氧化應(yīng)激。線粒體機(jī)能障礙和／或解偶聯(lián)，通過(guò)線粒體膜的透化作用、ATP損耗、壞死、凋亡容易造成肝細(xì)胞死亡。防止線粒體損傷將是酒精肝等疾病有效的治療方法之一［1］。酒精可增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化和氧自由基的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激提升。Chari等發(fā)現(xiàn)酒精性肝硬化病人SOD、MDA等過(guò)氧化相關(guān)物質(zhì)有顯著變化，而非酒精性肝硬化病人無(wú)明顯變化［2］。本研究探討急性酒精性肝線粒體損傷和肝過(guò)氧化相關(guān)物質(zhì)SOD、MDA的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑

475mL／L酒精，1%詹納斯綠B染液，0.25 mol／L緩沖蔗糖溶液，0.34mol／L緩沖蔗糖溶液，10%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸，13mol／L蛋氨酸溶液，63μmol／L氮藍(lán)四唑溶液，40μmol／L核黃素溶液。以上試劑由湖北工程學(xué)院生科院實(shí)驗(yàn)中心藥庫(kù)提供的相關(guān)藥品配制而成。

1.2 儀器設(shè)備

800型低速離心機(jī)，龍岡醫(yī)療機(jī)械廠制造；TGL－20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司制造；顯微鏡用測(cè)微尺，上海第三光學(xué)儀器廠制造；722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司制造。

1.3 動(dòng)物分組建模

20只雄性昆明小白鼠，體重34～46g，由湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組10只。實(shí)驗(yàn)組按體重10 g／kg 475mL／L酒精一次性灌胃，對(duì)照組灌胃生理鹽水。灌胃后48h取肝作相關(guān)檢測(cè)。

1.4 線粒體分離

按肝細(xì)胞勻漿制備方法制備1g小鼠肝組織勻漿，差速離心，取純化的線粒體沉淀物涂片，1%詹納斯綠B染色，蓋片后油鏡下取2個(gè)視野取線粒體的最長(zhǎng)和最寬處觀察測(cè)量線粒體長(zhǎng)和寬，求平均值。

1.5 MDA、SOD檢測(cè)

MDA檢測(cè)：每只小鼠取肝組織0.3g勻漿、離心、沸水浴、再離心，取上清分別在450nm、532nm、600nm下比色，計(jì)算MDA含量。

SOD檢測(cè)：每只小鼠取肝組織0.3g冰浴勻漿、低溫離心，取上清加樣，光照培養(yǎng)顯色，在550nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，計(jì)算SOD活性單位。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，求P值，判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體分離結(jié)果

對(duì)照組肝線粒體平均長(zhǎng)是3.31μm，實(shí)驗(yàn)組是4.63μm，兩者差異極顯著（P＜0.01）。對(duì)照組肝線粒體平均寬是0.72μm，實(shí)驗(yàn)組是0.92μm，兩者差異極顯著（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組肝線粒體變性，可見(jiàn)明顯的腫脹和斷裂，見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組小鼠肝線粒體腫脹和斷裂（詹納斯綠B染色，數(shù)顯光鏡，×5500）

2.2 MDA、SOD檢測(cè)結(jié)果

MDA檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組平均肝MDA是0.74μmol／g，實(shí)驗(yàn)組是1.63μmol／g，兩者差異極顯著（P ＜0.01）。

SOD檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組平均肝SOD是8.37U／g，實(shí)驗(yàn)組是3.70U／g，兩者差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

氧化應(yīng)激與酒精性肝病等多種肝病及其發(fā)病機(jī)制有關(guān)。急慢性酒精中毒者，NADH產(chǎn)生過(guò)多觸發(fā)了線粒體呼吸鏈酶Ⅰ、Ⅲ，氧自由基、過(guò)氧、活性氧產(chǎn)生增多可能是線粒體和細(xì)胞氧化應(yīng)激及其損傷的主要原因。線粒體氧化應(yīng)激容易使乙醇或乙醛介導(dǎo)的線粒體膜滲透性改變和細(xì)胞凋亡。急慢性酒精中毒和膽汁性肝硬化線粒體氧化應(yīng)激先于肝細(xì)胞凋亡［3］。在培養(yǎng)的肝細(xì)胞里，氧化應(yīng)激產(chǎn)生于乙醇代謝導(dǎo)致的線粒體膜除極和滲透性變化期間。線粒體的這些改變是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵一步。線粒體滲透性改變導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和半胱天冬酶激活。急慢性飲酒下調(diào)細(xì)胞內(nèi)尤其是線粒體內(nèi)抗氧化水平，易發(fā)細(xì)胞凋亡［4］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，線粒體DNA和核DNA的缺失都能引發(fā)線粒體疾?。?］。自由基引發(fā)線粒體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，不飽和脂肪酸破壞，MDA產(chǎn)生增多，導(dǎo)致線粒體膜流動(dòng)性下降，通透性增加［6］。本研究顯示線粒體有明顯的腫脹和斷裂可能與線粒體氧化應(yīng)激、線粒體膜通透性改變有關(guān)。

酒精對(duì)白細(xì)胞介素－6（IL－6）缺陷小鼠有很強(qiáng)的引導(dǎo)MDA產(chǎn)生的作用。IL－6可用于防治酒精導(dǎo)致的肝細(xì)胞活性氧及MDA的產(chǎn)生、線粒體滲透性改變、ATP的損耗［7］。Uzun等用酒精、葡萄糖、精氨酸甲脂分別灌胃大鼠4周后酒精組MDA較葡萄糖組、精氨酸甲脂組極顯著增高，SOD極顯著降低［8］。我們對(duì)急性酒精性肝損傷抗氧化物質(zhì)SOD、MDA的研究與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。Saravanan等在對(duì)照組用酒精處理大鼠60天后，血清肝標(biāo)志酶ALT、GGT、AST、ALP等升高，抗氧化物質(zhì)SOD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）降低，而實(shí)驗(yàn)組最后30天加用天仙子提取物處理大鼠后，肝標(biāo)志酶顯著降低，SOD、CAT、GPX等顯著升高。天仙子提取物對(duì)酒精性肝損傷自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有保護(hù)作用［9］?？寡趸⒖寡趸瘧?yīng)激也是急慢性酒精性肝損傷有效治療的一個(gè)方面。

［1］Serviddio G，Bellanti F，Sastre J，et al.Targeting Mitochondria：A New Promising Approach for the Treatment of Liver Diseases［J］.Current Medicinal Chemistry，2010，17（22）：2325－2337.

［2］Chari S，Gupta M.Status of blood antioxidant enzymes in alcoholic cirrhosis［J］.Indian J Physiol Pharmacol，2003，47（3）：343－346.

［3］Sastre J，Serviddio G，Pereda J，et al.Mitochondrial function in liver disease［J］.Frontiers Bioscience，2007，12：1200－1209.

［4］Adachi M，Ishii H.Role of mitochondria in alcoholic liver injury［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2002，32（6）：487－491.

［5］Huang C C，Hsu C H.Mitochondrial disease and mitochondrial DNA depletion syndromes［J］.Acta Neurol Taiwan，2009，18（4）：287－295.

［6］Deaciuc IV IV，D’Souza N B，F(xiàn)ortunato F，et al.Alcohol－induced sinusoidal endothelial cell dysfunction in the mouse is associated with exacerbated liver apoptosis and can be reversed by caspase inhibition［J］.Hepatology Research，2001，19（1）：85－97.

［7］El－Assal O，Hong F，Kim W H，et al.IL－6－deficient mice are susceptible to ethanol－induced hepatic steatosis：IL－6protects against ethanol－induced oxidative stress and mitochondrial permeability transition in the liver［J］.Cellular ＆ Molecular Immunology，2004，1（3）：205－211.

［8］Uzun H，Simsek G，Aydin S，et al.Potential effects of L－NAME on alcohol－induced oxidative stress［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，11（4）：600－604.

［9］Saravanan N，Nalini N.Antioxidant effect of Hemidesmus indicus on ethanol－induced hepatotoxicity in rats［J］.Journal of Medicinal Food，2007，10（4）：675－682.