李冰，遲玉杰，鮑志杰，孫臨政

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，教育部大豆生物學(xué)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

優(yōu)良的凝膠特性對大豆蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用起到了不可替代的作用，如在飲料、湯、醬，這樣的流體或半流體食品中，以及在香腸、丸子、肉類罐頭，這樣的固體或半固體中。而大豆蛋白在膠凝過程中的流變特性對食品最終優(yōu)良的理化及凝膠特性的形成至關(guān)重要。大豆蛋白的膠凝過程是溶液體系由液態(tài)到半固態(tài)(或固態(tài))轉(zhuǎn)變的過程。動態(tài)旋轉(zhuǎn)流變儀對待測樣品進行小振幅震蕩，即施加交變應(yīng)力，通過測量參數(shù)(彈性模量G’及黏性模量G”)的反饋來檢測蛋白質(zhì)凝膠的形成過程［1］。

為滿足食品領(lǐng)域?qū)τ诰哂袑ｍ椄吣z型產(chǎn)品的需求，常采用特定方法對大豆分離蛋白進行改性，其中糖基化反應(yīng)是目前眾多改性方法中較為理想的一種［2］。糖基化改性是基于一種自發(fā)反應(yīng)，不需要額外添加任何化學(xué)試劑，通過加熱就可以很大程度地加速該反應(yīng)的進程［3］。大豆分離蛋白根據(jù)沉降系數(shù)的不同可將其分為2S、7S、11S 和15S 4 種組分，其中7S 組分占30%以上主要由7S 球蛋白組成，11S 組分占40%以上由單一的11S 球蛋白構(gòu)成［4］。7S、11S 組分對凝膠的形成及其性質(zhì)起主要的作用，朱建華［5］等人采用小變形振蕩流變手段研究了葡聚糖分子質(zhì)量對大豆7S 蛋白凝膠的影響，結(jié)果表明，熱致大豆7S 蛋白凝膠的黏彈性質(zhì)隨所添加的葡聚糖分子質(zhì)量的增加而增加;許彩虹［6］等將3 種不同分子量葡聚糖與β-伴大豆球蛋白進行干熱反應(yīng)，得出以共價鍵結(jié)合的葡聚糖能夠和蛋白質(zhì)分子均勻的分布在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，不會引起相分離。故而以提高大豆分離蛋白凝膠特性為目的，針對主要組分的糖基化改性研究具有深遠意義。

本實驗在前人［2］研究基礎(chǔ)上，選用麥芽糖對大豆11S 球蛋白進行糖基化濕熱改性，Box-Behnken 模型進行工藝優(yōu)化，并運用流變學(xué)手段對糖基化產(chǎn)物膠凝過程進行監(jiān)測分析，旨在尋找到一種有效提高凝膠特性并適合工業(yè)化生產(chǎn)的改性方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕，哈高科大豆食品有限公司提供，經(jīng)粉碎，過60 目篩得到脫脂豆粉;麥芽糖，天津市天理化學(xué)試劑有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

飛鴿TGL-16aR 高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9023A 型)，上海森信實驗儀器有限公司;FDU-1100 型冷凍干燥機，日本Tokyo Rikakikai 公司;Bohlin Gemini2 旋轉(zhuǎn)流變儀，英國Malvern 公司;TA. XT. Plus 質(zhì)構(gòu)儀，Stable Micro system Ltd。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆11S 球蛋白分離純化

根據(jù)Nagano 法［7］從低溫脫脂豆粕中提取大豆11S 球蛋白，冷凍干燥后備用。

1.2.2 糖基化蛋白樣品的制備

將不同質(zhì)量的麥芽糖溶解于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，再與純化后的11S 球蛋白混勻制成100 g/L 蛋白濃度的混合物，保鮮膜封口置于一定溫度的水浴中，反應(yīng)一定時間后立即取出，冷卻至室溫，凍干后得到11S 球蛋白-麥芽糖糖基化產(chǎn)物。

1.2.3 糖基化蛋白凝膠的制備與測定［8－9］

將糖基化改性后的混合粉溶解于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，蛋白含量(以11S 蛋白計)120 g/L，充分攪拌3 h 后，于4℃下冷藏過夜確保蛋白質(zhì)充分水化，測定操作參照劉燕［10］等人的方法。

1.2.4 糖基化蛋白凝膠流變性質(zhì)的測定

采用馬爾文旋轉(zhuǎn)流變儀對樣品進行測定，樣品制備參照1.2.2 方法。測定時取待測樣品置于60mm平行板間，調(diào)節(jié)間距為0.5 mm，小心擦去過量樣品，在樣品裸露部分滴加一層薄硅油以防止加熱過程中水分的蒸發(fā)。采用動態(tài)振蕩模式，平衡溶液溫度30 s后自25℃升溫至90℃，恒溫30 min 后降溫至25℃，整個過程升降溫速率設(shè)為2℃/min，保持頻率0.1Hz，固定形變0.01。記錄此過程待測樣品的彈性模量(G’)及黏性模量(G”)隨時間變化的趨勢［11］。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計方案

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，考慮到實際生產(chǎn)要求，以麥芽糖添加量(X1)、反應(yīng)溫度(X2)、反應(yīng)時間(X3)為自變量，11S 球蛋白凝膠強度(Y)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析方法進行優(yōu)化，試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 試驗因素水平表Table 1 Experiment design for levels of factors

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆11S 球蛋白與麥芽糖糖基化反應(yīng)的單因素試驗

2.1.1 麥芽糖添加量(X1) 對凝膠強度的影響

由圖1 可知，在相同的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間下，糖基化產(chǎn)物凝膠強度隨著麥芽糖添加量的增加而呈先上升后下降，最終趨于平緩的變化趨勢，當(dāng)麥芽糖添加量為2%時，所得產(chǎn)物凝膠強度最高，這可能是因為糖的接入使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，疏水作用力增強。隨后的下降趨勢可能是因為生成的糖基化產(chǎn)物溶解性差，導(dǎo)致凝膠強度下降。當(dāng)麥芽糖添加量超過3%時，糖基化反應(yīng)趨于飽和，凝膠強度基本不變。

圖1 不同麥芽糖添加量對凝膠強度的影響Fig.1 Effect of adding contents of maltose on gel strength

2.1.2 反應(yīng)溫度(X2) 對凝膠強度的影響

從圖2 可以看出，在相同的麥芽糖添加量、反應(yīng)時間條件下，產(chǎn)物凝膠強度隨著反應(yīng)溫度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度為70℃時所得產(chǎn)物凝膠強度最高。分析原因可能是由于加熱初期大豆球蛋白空間結(jié)構(gòu)受熱展開，暴露出了原本埋藏在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基及巰基［12］，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性發(fā)生變化;而隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，一方面蛋白和麥芽糖反應(yīng)劇烈，生成的麥芽糖-蛋白復(fù)合物不易溶解;另一方面，蛋白間通過S-S 發(fā)生聚集，形成粗糙、富含不溶物的凝膠，從而使凝膠的強度有所下降。

圖2 不同反應(yīng)溫度對凝膠強度的影響Fig.2 Effect of different reaction temperature on gel strength

2.1.3 反應(yīng)時間(X3) 對凝膠強度的影響

如圖3 所示，在相同的麥芽糖添加量、反應(yīng)溫度條件下，產(chǎn)物的凝膠強度隨著反應(yīng)時間的增加呈先上升后下降的變化趨勢，當(dāng)反應(yīng)時間為50 min 時所得產(chǎn)物凝膠強度最大。大豆球蛋白反應(yīng)活性隨著反應(yīng)時間的增加而逐步提高，但達到某一時刻，蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的巰基會交聯(lián)形成S-S，使蛋白質(zhì)間彼此聚集，溶解性降低，凝膠強度下降。

圖3 不同反應(yīng)時間對凝膠強度的影響Fig.3 Effects of different reaction time on gel strength

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 糖基化反應(yīng)模型的建立

按照試驗設(shè)計方案進行試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計條件及結(jié)果表Table 2 Design and results of response surface experiment

應(yīng)用Design Expert7.1 軟件，對表2 中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可得麥芽糖添加量(X1)、反應(yīng)溫度(X2)、反應(yīng)時間(X3)與11S球蛋白凝膠強度(Y)的二次多項回歸方程:

Y1= 267.5 － 21.97X1－ 17.76X2－ 1.62X3－27.63X1X2+ 0.7X1X3+ 17.81X2X3－ 60.02X12 －

表3 11S 球蛋白凝膠強度的方差分析Table 3 Variance analysis of gel strength of 11S globulin

由表3 的方差分析可以看出，11S 球蛋白凝膠強度回歸方程模型F 檢驗顯著(P＜0.05)，失擬P值為0.491 4 大于0.05，失擬項不顯著，說明回歸方程的擬合程度較好，試驗誤差較小。同時，模型的決定系數(shù)R2=0.987 6，說明98.76%的變更可通過該模型解釋;模型的調(diào)整決定系數(shù)是0.971 7，說明該模型可以解釋97.17%的影響值變化，進而表明此模型擬合度高，可用于預(yù)測和分析不同反應(yīng)條件下，糖基化復(fù)合物的凝膠特性及對反應(yīng)條件的優(yōu)化［13］。

2.2.2 響應(yīng)面的優(yōu)化

根據(jù)試驗結(jié)果，經(jīng)回歸分析，得到各因素對凝膠硬度影響的響應(yīng)曲面圖，并確定最佳因素水平，結(jié)果如圖4 所示。

利用軟件Design Expert 7.1 對糖基化改性工藝進行優(yōu)化，以糖基化11S 球蛋白凝膠強度為指標(biāo)，當(dāng)麥芽糖添加量為1.85%，反應(yīng)溫度68.42℃，反應(yīng)時間50.08 min 時，凝膠強度可以達到269.43 g。根據(jù)實際情況，將麥芽糖添加量設(shè)定為2.0%，反應(yīng)溫度設(shè)定為70℃，反應(yīng)時間設(shè)定為50 min，在此條件下進行了3 次驗證試驗(數(shù)據(jù)未顯示)，取平均值，得到結(jié)果為270.52 g，相對偏差0.4%，表明Box-Behnken 模型可用于大豆球蛋白-麥芽糖糖基化反應(yīng)條件的優(yōu)化。且與未改性11S 球蛋白相比，共價改性的11S 球蛋白凝膠強度提高了20.7%，表明糖基化有效的提高了蛋白的凝膠特性。

2.3 大豆11S 蛋白及其糖基化產(chǎn)物凝膠流變學(xué)性質(zhì)

圖4 凝膠強度影響因素的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface analysis of influencing factors for gel strength

2.3.1 小振幅動態(tài)測試

檢測物質(zhì)的膠凝過程通常采用動態(tài)流變學(xué)手段［14－15］。動態(tài)測試中有2 個獨立參數(shù)，彈性模量G’和粘性模量G”，在凝膠形成過程中分別反映彈性性質(zhì)和粘性性質(zhì)，對于典型的凝膠體系，G’和G”相互平行，前者大于后者［6］。

圖5 所示為大豆11S 球蛋白及其糖基化產(chǎn)物G’和G”隨時間變化的趨勢。從圖5 中可以看出溫度掃描開始時，大豆11S 球蛋白的G’和G”均處于較低水平(＜10Pa)，體系以液態(tài)為主。當(dāng)升溫至90℃左右時，大豆11S 球蛋白G’和G”突然增長，當(dāng)G’＞G”時(90℃持續(xù)加熱10 min 后即2 648 s 處)出現(xiàn)凝膠點(當(dāng)聚集的蛋白質(zhì)從黏性的流體轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥缘哪z，在流變學(xué)中，該轉(zhuǎn)變點被稱為凝膠點，相對應(yīng)的溫度被稱為凝膠溫度。而事實上G’和G”的交叉點也被定義為凝膠溫度Tg［16］)，說明樣品溶液已經(jīng)開始從以液體性質(zhì)為主的溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐怨腆w性質(zhì)為主的凝膠狀態(tài)，這是由于蛋白質(zhì)受熱變性，不久后形成了初步的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所致［17］。

圖5 11S 及其糖基化產(chǎn)物的G’和G”隨凝膠加熱時間的變化Fig.5 Dependence of Storage G’(open symbols)，loss G’’(filled symbols)module and temperature on time for glycinin and glycated products

糖基化蛋白的G’和G”變化規(guī)律與11S 球蛋白單獨體系相類似，11S-麥芽糖糖基化產(chǎn)物溶液在溫控初始階段的彈性模量G’和黏性模量G”值略高于大豆11S 球蛋白單一體系，說明體系中糖分子的接入，提高了大豆11S 蛋白溶液的黏彈特性，使此時的蛋白樣品具有一定的弱凝膠性。隨著對糖基化產(chǎn)物蛋白體系的進一步加熱，溫度升至83℃左右時，糖基化產(chǎn)物彈性模量G’和黏性模量G”驟然升高，在G’＞G”時(90℃持續(xù)加熱8 min 后即2 489 s 處)出現(xiàn)凝膠點，表明樣品溶液已開始從液體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐怨腆w狀態(tài)為主的凝膠態(tài)。

在90℃恒溫階段，糖基化產(chǎn)物凝膠黏彈性較11S單一體系顯著提高，這是因為糖基化反應(yīng)使得體系中引入了麥芽糖分子即大量羥基，分子間氫鍵的形成機會大大增加所致。在此階段，11S 球蛋白結(jié)構(gòu)充分展開，凝膠網(wǎng)絡(luò)初步形成。之后的降溫階段，蛋白G’和G”上升平緩且趨于平行，說明體系已形成了較穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

(1)利用Box-Behnken 模型對大豆11S 球蛋白與麥芽糖糖基化反應(yīng)進行了優(yōu)化，方差分析表明擬合較好。優(yōu)化后的工藝條件為麥芽糖添加量1.85%，反應(yīng)溫度68.42℃，反應(yīng)時間50.08 min，凝膠強度可達269.43 g。根據(jù)實際情況，將麥芽糖添加量設(shè)定為2.0%，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時間50 min，此條件下驗證結(jié)果為270.52g，相對偏差為0.4%，且與未改性11S 球蛋白相比，凝膠強度提高了20.7%。

(2)采用旋轉(zhuǎn)流變儀對大豆11S 球蛋白及其糖基化產(chǎn)物的凝膠形成過程進一步分析得出:在整個溫度掃描過程中，大豆11S 糖基化產(chǎn)物凝膠的粘、彈性均大于大豆11S 球蛋白單一體系，宏觀表現(xiàn)為具有較好的凝膠特性，且相比于黏性模量G”，其彈性模量G’增長較快，凝膠形成點有所提前(即從2 648 s 提前到2 489 s)，說明糖基化反應(yīng)使得大豆11S 球蛋白形成了硬度較高的凝膠結(jié)構(gòu)，此結(jié)果與凝膠質(zhì)構(gòu)分析結(jié)論相一致。

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