★ 鄒志堅(jiān) 高增光 王曉敏** 席曉甜

(1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科 南昌 330002；2.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004)

姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞PI3K/Akt/Bcl-2信號通路的作用*

★ 鄒志堅(jiān)1高增光2王曉敏2**席曉甜2

(1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科 南昌 330002；2.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004)

目的：研究姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞增殖率、凋亡和PI3K/Akt/Bcl-2信號通路的影響。方法:采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制肺腺癌A549細(xì)胞生長曲線，MTT法測定姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞抑制率。將不同濃度姜黃素作用于肺腺癌A549細(xì)胞24h后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率；免疫組化法檢測PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果：姜黃素能夠抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖, 且呈一定劑量和時(shí)間依賴性；隨著藥物濃度上升細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)；PI3K、Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。結(jié)論:姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞增殖具有抑制作用,其作用可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制PI3K/Akt/Bcl-2信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

姜黃素 PI3K/Akt/Bcl-2 肺腺癌A549細(xì)胞

肺癌已是世界上發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一，絕大數(shù)肺癌患者被診斷時(shí)已不適合手術(shù)治療，放化療及分子靶向治療成為其主要的治療手段，但長期使用毒性大費(fèi)用高又影響其療效[1]。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，是一種高效、低毒，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡的天然藥物，但其作用機(jī)制尚不清楚[2]。PI3K /Akt/Bcl-2通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤。本課題研究姜黃素在體外對肺癌A549細(xì)胞的作用并通過檢測PI3K/Akt/Bcl-2表達(dá)改變從分子水平探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材 姜黃素純品、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜 (DMSO)、胰酶均為美國Sigma公司；肺腺癌細(xì)胞株A549由本室保存，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤生物學(xué)檢測中心提供；RPM I1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；PI3K、Akt、Bcl-2一抗為北京中杉金橋公司；胎牛血清為杭州四季清公司產(chǎn)品；TUNEL為武漢博士德公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。姜黃素用DMSO溶解配制成終濃度為50mg/L的母液，過濾除菌，避光存儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆?每次實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度 (DMSO終濃度< 1 /1000)。

1.2 儀器 電子分析天平(瑞士 梅特勒-托利多)；PH140A型培養(yǎng)箱/干燥箱(上海-恒科技有限公司))；CO2培養(yǎng)箱(美國 Forma Scientific)；酶標(biāo)儀(美國Multiskan)；UV-2102紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)；徠卡DL2500顯微鏡(德國徠卡)；徠卡CCD圖像采集系統(tǒng)(德國徠卡)；Image-Pro Plus 6.0(美國冷泉公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 肺腺癌A549 細(xì)胞加入含10%小牛血清、青霉素及鏈霉素各100U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至對數(shù)增殖期。更換含0、6.25、12.5、25、50mg /L姜黃素新鮮培養(yǎng)液，用順鉑(DPP，25mg /L )為陽性對照組。

2.2 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTT法) 將對數(shù)生長期肺腺癌A549 細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中, 細(xì)胞密度約為1.0×105/mL,每孔加入200μL細(xì)胞懸液, 培養(yǎng)24h。吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液, 加入含姜黃素的10% 胎牛血清RPM I1640培養(yǎng)液200μL, 每個(gè)藥物濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔, 另設(shè)順為陽性對照組和空白對照孔。姜黃素各濃度組藥物作用時(shí)間分別為12、24、48、和72h, 培養(yǎng)至倒數(shù)4h ,每孔加入MTT (5mg /mL) 20μL, 繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng), 小心吸棄孔內(nèi)上清液, 每孔加DMSO150uL，用震蕩混合儀震蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。選擇492nm波長酶標(biāo)儀測定每孔光吸收值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。按下公式計(jì)算抑制率∶抑制率(%) = ( 1 -實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。并求出IC50 (細(xì)胞抑制率為50% 時(shí)的藥物濃度)。

2.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡檢測步驟按原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。藥物作用48h后，收集各組細(xì)胞，用PBS漂洗2遍后進(jìn)行細(xì)胞涂片，風(fēng)干后丙酮固定15min；細(xì)胞在滲透液( 0.2% Triton X -100，0.1%檸檬酸鈉)中孵育5min，雙蒸水沖洗玻片；滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37℃ 濕盒中孵育30min；滴加轉(zhuǎn)化劑，37℃濕盒中孵育30min，沖洗玻片；滴加DAB底物溶液，室溫5-10min；蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、封片；以不加TUNEL反應(yīng)混合液作為陰性對照片。以核呈棕黃褐色為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，而陰性細(xì)胞核著藍(lán)色。利用Image-Pro Plus 6.0(美國冷泉公司)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。隨機(jī)計(jì)數(shù)每組細(xì)胞低倍鏡下10個(gè)視野中的陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而得出每組細(xì)胞的陽性率。

2.4 免疫組化法檢測PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表達(dá) 按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作：藥物處理細(xì)胞48h后，收集各組細(xì)胞，PBS沖洗兩次,制成細(xì)胞懸液涂片，風(fēng)干后丙酮固定15min；3%過氧化氫孵育5min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加PI3K/Akt/Bcl-2一抗(稀釋1∶100-200)，室溫90min，PBS 沖洗, 3min×3次；滴加IgG抗體- HRP多聚體20-30min，PBS沖洗5min×3次；用DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

3 結(jié)果

3.1 MTT檢測結(jié)果顯示： 6.25-50mg/L姜黃素和順鉑處理肺癌A549細(xì)胞12、24、48、72h后均能明顯抑制細(xì)胞的增殖活性，且在一定范圍內(nèi)有劑量和時(shí)間依賴性，與培養(yǎng)基對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。而25、50 mg /L姜黃素處理肺癌A549細(xì)胞72h后，對其增殖抑制作用不明顯。見圖 1。

圖1 不同濃度姜黃素對肺癌抑制的影響

3.2 姜黃素對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒作用： 不同濃度姜黃素作用A549細(xì)胞后，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察：對照組細(xì)胞呈梭形或多邊形，細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞透亮折光性好，細(xì)胞增殖旺盛。而在12.5、25mg /L劑量組，細(xì)胞數(shù)減少，呈梭形或少許圓形貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，且隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長而愈加明顯。50mg /L劑量組細(xì)胞折光性差，明顯增大，輪廓模糊，胞內(nèi)空泡增多，部分壞死漂浮培養(yǎng)液中。

3.3 姜黃素對A549細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL 檢測結(jié)果顯示, 正常對照組、12.5mg /L姜黃素組、25mg /L姜黃素組、50mg /L姜黃素組和 DDP組的陽性細(xì)胞的百分率 (凋亡率)分別為(4.22±0.15)% 、(13.14±1.45)% 、(17.72±2.68)% 、(23.54±3.76)% 和 (32.32±4.38) % ，各濃度姜黃素組A549細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對照組 (P< 0. 05) 。

3.4 姜黃素對A549細(xì)胞PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 免疫組化檢測結(jié)果顯示，姜黃素處理A549細(xì)胞24h后, 與對照組相比，各濃度姜黃素組PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見表 1。

表1 姜黃素對A549細(xì)胞PI3K/Akt /Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

姜黃素(Cureumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃(Cureumalonga)根莖中提取的一種酚類色素，大量研究表明姜黃素具有抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。最近美國NCI已將其列為第三代防癌藥，進(jìn)行大量臨床研究。大量研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對人肝癌細(xì)胞、人腎癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞生長等都具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有廣泛抗腫瘤作用[3,4]。本實(shí)驗(yàn)用 MTT法檢測姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用, 結(jié)果顯示姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷能力, 且呈一定的劑量-時(shí)間依賴性。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn), 肺腺癌A549細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增高而明顯上升。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表達(dá)變化, 結(jié)果顯示隨著藥液濃度的升高, 而PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表達(dá)減弱。提示姜黃素抑制抗凋亡基因Bcl- 2的表達(dá)。

肺癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖失控有關(guān)和凋亡的相對減少密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過抑制凋亡來實(shí)現(xiàn)克隆性增生。Bc1-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)。在大多數(shù)正常機(jī)體組織中Bcl-2表達(dá)很低，而在腫瘤細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)增高，而且惡性程度越高，Bcl-2表達(dá)也越高，腫瘤細(xì)胞越易出現(xiàn)凋亡抑制[5]。在真核生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中普遍存在，PI3K/Akt通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤[6]。非小細(xì)胞肺癌中PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)水平明顯上調(diào)[7]。Akt是PI3K下游直接的靶蛋白，直接被PI3K 激活，可上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制由c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，或活化細(xì)胞內(nèi)其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的適應(yīng)性生存[8]。PI3K /Akt活化后可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB)的轉(zhuǎn)錄活性、磷酸化cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)等誘導(dǎo)Bcl-2基因的表達(dá)[9]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示姜黃素可能通過抑制PI3K /Akt信號通路蛋白的表達(dá), 達(dá)到下調(diào)凋亡抑制Bcl-2蛋白, 以及解除其對促凋亡基因或因子的抑制作用, 從而促使肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。

總之, 姜黃素具有誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡作用, 其機(jī)制可能Bcl- 2基因表達(dá)有關(guān)，并通過抑制PI3K /Akt信號通路來實(shí)現(xiàn)，其確切機(jī)制有待深入研究。

[1]Cuffe S, Bourredjem A, Graziano S, et al. A pooled exploratory analysis of the effect of tumor Size and KRAS mutations on survival benefit from adjuvant platinum-based chemotherapy in node-negative non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol,2012,7(6)：963-972.

[2]王晶宇,王志平,趙俊麗,等. LY294002聯(lián)合姜黃素對人膀胱癌EJ細(xì)胞的體外抑制作用[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志,2011(1)：37-41.

[3]杜琴,鄧珊,沈克平,等. 姜黃素對Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡及ROS影響[J].中藥藥理與臨床,2011(6)：28-31.

[4]單延紅,張海軍,徐志剛,等. 姜黃素聯(lián)合人類細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011(2)：220-225.

[5]Kim E M, Kim J, Park J K, et al. Bcl-w promotes cell invasion by blocking the invasion-suppressing action of Bax[J]. Cell Signal,2012,24(6)：1 163-1 172.

[6]Park H S, Park K I, Lee D H, et al. Polyphenolic extract isolated from Korean Lonicera japonica Thunb. induce G2/M cell cycle arrest and apoptosis in HepG2 Cells: Involvements of PI3K/Akt and MAPKs[J]. Food Chem Toxicol,2012,50(7)：2 407-2 416.

[7]祁慧薇,范理宏. PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與非小細(xì)胞肺癌[J]. 中國肺癌雜志,2010(12)：1 149-1 154.

[8]Fan Y, Dickman K G, Zong W X. Akt and c-Myc differentially activate cellular metabolic programs and prime cells to bioenergetic inhibition[J]. J Biol Chem,2010,285(10)：7 324-7 333.

[9]Meng L Y, Liu H R, Shen Y, et al. Cochinchina momordica seed extract induces G2/M arrest and apoptosis in human breast cancer MDA-MB-231cells by modulating the PI3K/Akt pathway[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(12)：3 483-3 488.

EffectofCurcuminonPI3K/Akt/Bcl-2PathwaySignalingLungAdenocarcinomaCellA549

ZOUZhi-jian1，GAOZeng-guang2，WANGXiao-min2，XIXiao-tian2

1.Departmentofoncology，ThefourthAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330002；2.Schoolofbasicmedicalsciences，JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004

Objective：To explore the effect of curcumin on PI3K/Akt/Bcl-2 Pathway Signaling of lung adenocarcinoma cell A549.Methods：Cell counting was used to plot the cell growth curves of A549 cells. The inhibition rate of A549 cell in different concentrations of curcumin were measured by MTT assay. After the cells were treated with curcumin，cellular morphology was observed under microscope. The apoptosis rate was detected by TUNEL. PI3K/Akt/Bcl-2 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining. Results：Curcumin could restrain the proliferation of A549 cells and inhibitory effect was dose-and-time-dependent. The rate of apoptosis increased significantly with the increasing concentrations of the drug, The expression of PI3K/Akt/Bcl-2 proteins were decreased significantly(P<0.05). Conclusion：Curcumin exerts inhibitory effects on proliferation of A549 cells possibly through inducing cell cycle apoptosis and inhibition of PI3K/Akt/Bcl-2 pathway signaling.

Curcumin；PI3K/Akt/Bcl-2；Lung Adenocarcinoma Cell A549

江西省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：20131104)。

**通訊作者：王曉敏，女，江西余干人，博士，副教授，研究方向：從事中藥對腫瘤防治研究，E-mail：wangxm2001@163.com 。

R 285.5

A

2013-07-27)