鄭金旺

（上海東富龍科技股份有限公司，上海 201108）

過氧化氫是一種較強的氧化劑，分子具有非對稱的鏈狀結構。過氧化氫分子極易穿透微生物的細胞膜，與細胞內(nèi)的過渡金屬離子（或其他物質）作用，產(chǎn)生羥基自由基，從而攻擊細菌、霉菌、芽孢及病毒中的酶、核酸等生命大分子物質，致使微生物滅活[1]。2001年，過氧化氫被美國環(huán)境保護署（EPA）推薦作為滅菌劑對房屋和建筑進行消毒[2]。隨后，過氧化氫蒸氣滅菌設備被開發(fā)并在歐美各國的制藥、生物、醫(yī)療和衛(wèi)生保健等領域得到廣泛應用。

隨著中國GMP（2010版）的頒布和實施，我國制藥行業(yè)對無菌生產(chǎn)的要求不斷提升，真空冷凍干燥機實現(xiàn)‘在位滅菌’（Sterilization-in-place，SIP）是凍干機通過GMP（2010版）認證的最基本前提。然而，據(jù)統(tǒng)計，目前在國內(nèi)運營的所有凍干生產(chǎn)線中，約60%的凍干機不具備SIP的功能。由于過氧化氫蒸氣滅菌工藝具有殺菌作用快速、滅菌能力強、刺激性小、腐蝕性低、環(huán)保等優(yōu)點，越來越多的制藥企業(yè)考慮用過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)對缺乏SIP的凍干機進行滅菌。

我公司將自主研發(fā)的過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)（HPVS V-50）應用于Tofflon Lyo-40-CIP凍干機（不具備SIP功能）進行滅菌，其滅菌效果良好。

圖1 過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)（HPVS V-50）

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子，孢子量106）、化學指示劑、TSB、30% 500 ml過氧化氫溶液、無菌操作臺、記號筆、便攜式過氧化氫氣體濃度探測器（ATi-PortanSen Ⅱ）及手持式溫濕度測量儀（Testo-645）。

1.2 HPVS V-50滅菌器

HPVS V-50滅菌器是由上海Tofflon公司自主研發(fā)的針對密閉區(qū)域進行滅菌的過氧化氫蒸氣發(fā)生系統(tǒng)。整個過氧化氫蒸氣滅菌過程分為泄露測試、預處理、高速注入、低速注入和通風五個階段。

（1）泄露測試：通過泄露測試以確認該系統(tǒng)的密閉性良好。

（2）預處理：調(diào)節(jié)并控制凍干機箱體的相對濕度和溫度在設定參數(shù)范圍內(nèi)。

（3）高速注入：30%的雙氧水被不斷汽化成含有高濃度的過氧化氫氣體的蒸氣。

（4）低速注入：保持過氧化氫足夠的作用時間和濃度以確保微生物被完全滅活。

（5）通風：該階段不再向凍干機內(nèi)部注入過氧化氫蒸氣，凍干機箱體內(nèi)部殘余的過氧化氫氣體催化分解成水和氧氣。在本案例中，通過真空空氣置換以排除箱體內(nèi)部的殘余過氧化氫氣體，從而使凍干機箱體內(nèi)部的過氧化氫氣體濃度低于職業(yè)允許暴露水平（1 ppm）。

1.3 Lyo-40 CIP凍干機的過氧化氫滅菌

該Lyo-40 CIP凍干機由Tofflon 公司生產(chǎn)，具有14個板層，總板層面積為40 m2，干燥箱內(nèi)腔體的體積約11.5m3（2.20 m×2.20 m×2.35 m），具備“在位清洗”（Cleaning-in-place，CIP）功能，不具備SIP功能。

在對凍干機進行簡單改造后，通過Φ38氣體傳輸管道將HPVS V-50滅菌器與凍干機連接，并形成閉合的氣流循環(huán)回路，如圖1所示。HPVS V-50滅菌器通過充氣管道將過氧化氫蒸氣注入到凍干機箱體內(nèi)部，然后再通過回氣管道將未充分作用的過氧化氫蒸氣回流到滅菌器中，如此不斷循環(huán)直到滅菌結束。

圖2 凍干機與HPVS V-50滅菌器連接示意圖

Lyo-40凍干機的過氧化氫滅菌循環(huán)參數(shù)是Tofflon公司根據(jù)凍干機的結構、規(guī)格和溫濕度狀況并通過滅菌工藝開發(fā)程序確定的滅菌參數(shù)，如表1所示。

1.4 滅菌循環(huán)的監(jiān)測與驗證

在滅菌過程中，通過HPVS V-50滅菌器的參數(shù)測量系統(tǒng)對凍干機箱體的壓力、氣流傳遞的管道內(nèi)相對濕度、過氧化氫溶液注入流量、風機轉速、氣流傳遞溫度、汽化溫度及過氧化氫氣體濃度等參數(shù)進行監(jiān)測。此外，通過手持式溫濕度測量儀對滅菌初始溫濕度進行驗證，并通過便攜式過氧化氫氣體濃度探測器對滅菌循環(huán)結束后的凍干機箱體內(nèi)部過氧化氫氣體濃度值進行確認。在滅菌結束后，將該濃度傳感器放置于過氧化氫濃度驗證孔（如圖2的接口7所示）進行測量，以確認該凍干機箱體內(nèi)部的過氧化氫氣體的濃度值低于國家規(guī)定的過氧化氫職業(yè)允許暴露水平值（1ppm）。

表1 Tofflon Lyo-40 CIP凍干機的過氧化氫滅菌參數(shù)

過氧化氫蒸氣滅菌效果的監(jiān)測和驗證主要采用化學指示劑和生物指示劑。通過化學指示劑在滅菌循環(huán)作用前后的色帶顏色變化，以評定該滅菌循環(huán)的過氧化氫濃度分布和滅菌作用情況。而生物指示劑用來評估過氧化氫滅菌循環(huán)的滅菌效力，并確認該滅菌工藝的滅菌效果達到無菌保證水平（SAL）。該生物指示劑是由載有孢子數(shù)約為106的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的不銹鋼載片和Tevek包裝組成。

滅菌效果的監(jiān)測和驗證過程：在每個滅菌循環(huán)運行前，將已編號的化學指示劑和生物指示劑放置于凍干機箱體內(nèi)部相應的滅菌挑戰(zhàn)位點（如圖3所示），然后運行滅菌循環(huán)，在滅菌循環(huán)完成后，將指示劑其逐個取出，記錄化學指示劑的監(jiān)測結果，而將生物指示劑經(jīng)過無菌操作置于放入對應編號的TSB培養(yǎng)基中，然后將其置于在55℃～60℃條件下培養(yǎng)7天后觀察生物指示劑培養(yǎng)結果。培養(yǎng)基保持紫色不變，則視無菌生長；同時陽性對照培養(yǎng)基由紫色澄清液體變?yōu)辄S色渾濁即表示合格。連續(xù)運行三次該滅菌循環(huán)以確認該滅菌工藝的可重演性。

圖3 BI/CI測試位點圖

2 結果

由于監(jiān)測位點的不同及滅菌循環(huán)的差異，化學指示劑受過氧化氫作用的程度都有所不同，造成化學指示劑監(jiān)測效果的差異。為了較好地統(tǒng)計和說明化學指示劑對過氧化氫滅菌工藝的監(jiān)測效果，我們將測試后的化學指示劑的變色的程度進行分類以區(qū)分。其中，將經(jīng)歷一個完整的滅菌循環(huán)作用后，色卡顏色為紫藍色的化學指示劑標記為A；而受過氧化氫作用程度較差，有一定變色（深灰色）的化學指示劑標記為B；將受過氧化氫作用程度適中但未完全呈現(xiàn)米黃色的化學指示劑標記為C；最后，將色卡顏色為米黃色的化學指示劑標記為D。如表2所示，3次滅菌循環(huán)的每個滅菌循環(huán)的32個監(jiān)測位點的CI均由紫藍色變成米黃色，說明該滅菌工藝的過氧化氫氣體分布較均勻。然而，凍干機箱體底部（除#12位點外，#11～#14）及凍干機箱體側壁的中心區(qū)域（#6～#9）的過氧化氫指示劑變色程度較其他位點要明顯一些，說明這些位點或區(qū)域較其他位置受過氧化氫作用程度要充分一些。

除臭規(guī)?？傦L量Q為13 000 m3/h，共計2套處理系統(tǒng)，其中，一期設計風量9 000 m3/h，二期設計風量4 000 m3/h，除臭工藝采用生物土壤濾池除臭技術。首先將O池中的惡臭氣體密封加蓋，防止惡臭氣體外溢，采用不銹鋼收集風管進行收集，通過引風機將惡臭氣體引至生物土壤濾池進行處理，處理后的氣體無組織達標排放。

表2 化學評估-CI測試結果

表3 BI培養(yǎng)結果

表4 #27位點-微生物挑戰(zhàn)測試結果

如表3所示，除第2次滅菌循環(huán)的#27位點外，經(jīng)歷三次連續(xù)的滅菌循環(huán)的所有滅菌監(jiān)測生物指示劑的培養(yǎng)結果皆為陰性。在第2次滅菌循環(huán)的位點#27處（即從上至下的第2個板層中心）的BI培養(yǎng)結果顯示為陽性。

第2次滅菌循環(huán)的#27位點出現(xiàn)陽性結果，可能是因為在生物指示劑培養(yǎng)操作過程中驗證人員操作不慎造成該位點的指示劑培養(yǎng)出現(xiàn)“假陽性”結果；也可能是在第2次滅菌循環(huán)#27位點的生物指示劑為Rogue BIs[3]，由于Rogue BIs的細菌孢子結塊或簇積從而使該生物指示劑呈現(xiàn)更強的滅菌抗性，造成滅菌失敗。隨后，我公司在#27位點再放置3個生物指示劑并重復運行3次上述滅菌循環(huán)，以此對該位點進行確認。#27位點的微生物挑戰(zhàn)實驗生物指示劑培養(yǎng)結果，如表4所示，該位點的挑戰(zhàn)生物指示劑連續(xù)經(jīng)歷3次該滅菌循環(huán)未出現(xiàn)有菌生長。

此外，在應用安全性方面，我公司用過氧化氫濃度探測儀對HPVS V-50滅菌器設備周圍環(huán)境及凍干機內(nèi)部的殘留濃度進行測量。結果如表5所示，在滅菌過程中，HPVS滅菌器周圍環(huán)境中的過氧化氫氣體的濃度低于1ppm；在每次滅菌循環(huán)結束后，凍干機箱體內(nèi)部的過氧化氫濃度都低于1ppm。說明該滅菌系統(tǒng)的密閉性良好；并且在滅菌循環(huán)結束后，凍干機箱體內(nèi)部過氧化氫氣體已經(jīng)排盡。

表5 過氧化氫滅菌安全監(jiān)測結果

總之，對過氧化氫蒸氣滅菌工藝的滅菌效果監(jiān)測和驗證可知，凍干機應用過氧化氫蒸氣進行滅菌的滅菌效果良好。應用HPVS V-50過氧化氫蒸氣滅菌器對Tofflon Lyo-40-CIP凍干機進行滅菌對人和環(huán)境沒有造成危害。此外，在滅菌循環(huán)結束后，凍干機箱體內(nèi)部沒有產(chǎn)生過氧化氫殘留，過氧化氫氣體濃度低于職業(yè)允許暴露水平值（1ppm）。

3 討論

目前國內(nèi)制藥企業(yè)正在使用的真空冷凍干燥機絕大多數(shù)不具備在線蒸汽滅菌系統(tǒng)。凍干機改造添加SIP系統(tǒng)需要滿足以下條件：

（1）凍干機按D類壓力容器進行設計和制造，并備有壓力容器設計檢測證書和備案證書；

（2）該凍干機的熱循環(huán)系統(tǒng)使用硅油作為導熱油；

然而，國內(nèi)大多數(shù)凍干機不能滿足上述條件，通過給不具備SIP功能的凍干機配備過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)，通過充氣管道和回氣管道將滅菌器與凍干機連接并形成氣流閉合回路，即可使凍干機實現(xiàn)“在位滅菌”。

凍干機內(nèi)部復雜的結構（CIP清洗管道、擱板、蘑菇閥和冷凝盤管等部件）影響過氧化氫蒸氣的分布和擴散，合理的過氧化氫氣體傳輸以及較好的過氧化氫擴散方案較為重要。利于過氧化氫蒸汽的擴散的CIP管道布置、避免在過氧化氫蒸氣傳輸過程中熱量過度的損失、凍干機前后箱底面的斜面排水優(yōu)化設計、在凍干機滅菌過程中實行分段滅菌和真空氣流置換等措施都有利于凍干機充分滅菌。

在凍干機的滅菌驗證過程中，通過確立凍干機滅菌最不利位點（Worst case location）、使用更多的指示劑及添加更多的監(jiān)測位點都能較全面地對該滅菌工藝進行驗證和評估。

總之，規(guī)范的滅菌工藝、科學有效的滅菌監(jiān)測和驗證、嚴格的無菌控制和保障，成為當前我國無菌制劑生產(chǎn)滿足國內(nèi)外市場日益增高的質量訴求和認可的首要前提?，F(xiàn)代中國制藥行業(yè)高速發(fā)展并日漸成熟，凍干機實現(xiàn)在位滅菌已勢不可擋，越來越多的真空冷凍干燥機通過簡單改造配置過氧化氫蒸氣發(fā)生系統(tǒng)，從而實現(xiàn)“在位滅菌”。我們相信過氧化氫蒸氣滅菌工藝因其低溫、快速、易驗證、無毒及環(huán)保等優(yōu)點將會在制藥行業(yè)有更大的發(fā)展。

[1] 袁勤生. 超氧化物歧化酶[M].上海：華東理工大學出版社，2009：209-210.

[2] Andrew M. McAnoy. Vaporous Decontamination Methods:Potential Uses and Research Priorities for Chemical and Biological Contamination Control[M].Australia：Australian Government Department of Defence，2006.

[3] James E.Akers. Acceptance Criteria In the Validation of VPHP Decontamination[R].A3P 22nd Congress, October 2010.