馬俊紅，王昕，肖生祥

（1.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，北京100016；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安710004）

羊毛狀發(fā)(woolly hair)于1919年由Gottiieb首先報道，是一種少見的先天性毛發(fā)異常性疾病。羊毛狀發(fā)常在2歲前出現(xiàn)，表現(xiàn)為局部或彌漫性毛發(fā)松動生長緩慢，顏色灰白，毛發(fā)纖細脆弱易斷裂。羊毛狀發(fā)可以單獨發(fā)病，也可以是某些遺傳綜合征如Naxos和Carvajal綜合征的部分表現(xiàn)[1-2]。單純羊毛狀發(fā)可呈常染色體顯性遺傳（MIM 19400）或隱性（MIM 278150）兩種遺傳模式。最近報道一些常染色體隱性遺傳羊毛發(fā)患者不僅表現(xiàn)羊毛發(fā)，還有不同程度的毛發(fā)稀疏/少毛[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體（purinergic receptor P2Y,G protein-coupled 5,P2RY5）和脂肪酶 H（lipase－H,LIPH）基因突變可引起常染色體隱性羊毛發(fā)/稀毛癥[4-5]。最近我們確診1例散發(fā)羊毛狀發(fā)患者，進行了P2RY5和LIPH基因檢測，并確定了一新突變，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 先證者，女，21歲。自出生后頭發(fā)即稀疏、卷曲、柔軟，頭發(fā)顏色灰白?；颊咦杂杏洃浺詠砦丛舭l(fā)過，頭發(fā)緩慢生長至10 cm左右便基本停止生長，平時頭發(fā)易纏繞，不易梳通，輕拔毛發(fā)即脫落。患者無智力及骨骼發(fā)育異常。既往體健，足月順產(chǎn)。平素月經(jīng)規(guī)律。其父母非近親結(jié)婚，家族成員中無類似疾病患者。體格檢查：營養(yǎng)、智力、骨骼發(fā)育均正常，心、肺檢查無異常。皮膚科檢查：頭發(fā)稀疏、柔軟，觸之有綿羊毛狀感，毛發(fā)呈螺旋狀卷曲蓬松。類似燙發(fā)，呈淡灰白色，表面無光澤，見圖1b。頭皮毛囊無角化、隆起，毛發(fā)遠端未見分叉。眉毛稀疏，腋毛、陰毛、體毛缺如。雙拇趾甲見橫溝，甲松脆。未見掌跖角化過度。無全身出汗不良。光學(xué)顯微鏡下見發(fā)斷面呈不規(guī)則形，毛發(fā)粗細及黑素均勻。毛干表面見多數(shù)不規(guī)則小突起，無結(jié)節(jié)、氣泡。不呈管狀。電鏡下見毛干表面有縱溝，毛小皮結(jié)構(gòu)呈波紋狀排列，部分毛皮質(zhì)游離緣外翹突起或呈鋸齒狀，見圖 1c，d[6]。診斷：羊毛狀發(fā)。

圖1 羊毛狀發(fā)患者家系和臨床特征（a）家系圖，（b）患者臨床表現(xiàn)（c、d）毛發(fā)電鏡圖：不規(guī)則排列的毛小皮，鋸齒狀游離緣

1.2 基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）提取 經(jīng)院倫理委員會同意，獲得患者知情同意后采集患者及其他3例家屬的靜脈血液5 mL，置2%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝管中，使用全基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA（試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供），同時抽取100例無關(guān)正常人外周靜脈血作為對照。

1.3 PCR擴增及測序 參考文獻[5-6]設(shè)計引物，設(shè)計針對P2RY5和LIPH基因的所有編碼區(qū)和外顯子側(cè)翼區(qū)50～200 bp引物。其中LIPH基因3號外顯子引物：LIPH-4F 5′-GCCTCAGTTTCCTCATCTGC-3′，LIPH-4R 5′-CAATGACCCACACTCAGAG-3′。擴增片段大小為433 bp，PCR反應(yīng)體系：dNTP Mixture（10mmol/L）25μL，上下游引物各（25μmol/L）1.5μL，模板 DNA 10 μL，加水至 50 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性10 min，然后94℃ 30 s，60℃ 60 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳證實為所需產(chǎn)物，所有PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果與人類基因組LIPH基因序列比較。

2 結(jié)果

2.1P2RY5 首先對P2RY5基因所有外顯子檢測，沒有發(fā)現(xiàn)任何堿基改變。

2.2LIPH基因檢測結(jié)果 在LIPH基因第3號外顯子發(fā)現(xiàn)一個堿基改變，c.454G>A，該突變位于cDNA的第454位，此堿基變化將使得LIPH蛋白第152位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼幔╬.G152R），見圖2a。而其父母和妹妹均無此堿基改變，見圖2b，100例無關(guān)人群基因組檢測未發(fā)現(xiàn)相同堿基改變,表明此堿基改變不是一個單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

圖2 LIPH基因3號外顯子測序圖（a）先證者雜合性突變c.454G>A；（b）先證者的父母親和妹妹；（c）正常人群未檢測到該突變

3 討論

羊毛狀發(fā)是一種臨床少見的遺傳性毛發(fā)疾病，近10年來研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)P2RY5基因為其致病基因，并發(fā)現(xiàn)許多堿基突變。但由于羊毛狀發(fā)表現(xiàn)不僅僅出現(xiàn)在羊毛狀發(fā)患者，一些其他毛發(fā)疾病或綜合征也可出現(xiàn)羊毛狀發(fā)表現(xiàn)。最近在一些具有羊毛狀/稀毛癥患者基因組中檢測到LIPH基因堿基突變。筆者對一個羊毛狀發(fā)家系進行基因檢測，并在LIPH基因中檢測到一個新發(fā)突變。此突變?yōu)橐浑s合性錯義突變。目前已在不同地區(qū)和種族檢測到20多種突變，這些突變包括移碼突變和錯義突變和剪接突變。大多數(shù)突變是純合性突變，其次是復(fù)合雜合性突變形式。本例患者來自一個非血緣關(guān)系家庭，臨床表現(xiàn)及毛發(fā)電鏡均證實為羊毛狀發(fā)。最初我們認為患者為常染色體隱性遺傳模式，但是P2RY5基因序列分析未發(fā)現(xiàn)任何堿基改變。隨后對LIPH基因檢測發(fā)現(xiàn)3號外顯子第454位一個堿基G到A改變，即c.454G>A（p.G152R），此堿基改變?yōu)橐浑s合性改變，而在其父母親和100例無關(guān)人群中未發(fā)現(xiàn)此堿基改變，亦未發(fā)現(xiàn)其他形式的缺失突變類型，因此認為c.454G>A（p.G152R）為一新生突變，該患者可能為常染色體顯性遺傳模式。

LIPH基因編碼一種451個氨基酸的蛋白質(zhì)LIPH，分子質(zhì)量55 ku，是哺乳動物三酰甘油脂肪酶家族的膜結(jié)合成分，主要功能是催化產(chǎn)生2-?；苎字幔╨ysophosphatidic acid,LPA）。LIPH蛋白和其他脂肪酶成員一樣，在氨基末端催化區(qū)的154，178，248位置有3個具有催化作用的殘基，其具有一個β9回路（β9 loop）和一個類似蓋子的區(qū)域（lid domain），這兩個被認為是識別底物的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[7]。LPA是具有多種生物活性的磷脂介質(zhì)，活體內(nèi)試驗顯示其有促進毛發(fā)生長作用。LPA主要通過細胞表面特異的受體蛋白發(fā)揮作用，稱G蛋白偶聯(lián)受體。P2Y5為LPA一種受體。P2Y5是由P2RY5基因編碼的G蛋白偶聯(lián)型受體[8]。研究顯示P2Y5蛋白在內(nèi)毛根鞘的亨利層和赫胥黎層與基底膜層有表達[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)人類LIPH基因在毛軸內(nèi)膜根鞘的赫胥黎層，外毛根鞘也有大量的表達。由此可見LIPH基因和P2RY5基因在毛囊內(nèi)毛根鞘的赫胥黎層和基底膜層有顯著的重疊。這些研究都提示LIPH/LPA/P2RY5途徑在毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長中的重要作用[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)的p.G152R突變發(fā)生在LIPH蛋白N-末端的氨基酸催化殘基154位附近，精氨酸（Arginine,R）是高度堿性氨基酸，甘氨酸（Glycine,G）是非極性的。因此，突變p.G152R很可能嚴(yán)重影響LIPH蛋白的構(gòu)象，以及可能會影響LIPH蛋白二級結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)折疊，進一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。另外LIPH蛋白的152位氨基酸殘基在不同物種間是高度保守的見圖3，表明此蛋白在生物進化中具有重要功能活性，此位點堿基改變將嚴(yán)重影響LIPH蛋白的生物功能。綜上所述，筆者認為p.G152R突變引起了患者毛發(fā)生長和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致患者臨床表型。

綜上，本研究報道一個LIPH基因雜合性錯義突變，此突變增加了羊毛狀發(fā)患者突變基因庫，也間接證實了LIPH/LPA/P2Y5軸在人類的頭發(fā)生長發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

圖3 (a)LIPH蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)。*表示Ser154（第3外顯子），Asp178（第4外顯子），His248（外顯子6）3個催化殘基。紅色顯示本研究突變p.G152R，位于Ser154催化殘基附近。β：β9回路;LD：蓋域。（b）不同物種間LIPH氨基酸序列比較：顯示152位氨基酸高度保守。

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