李榮霞，劉首娟，孔德勝，李 敏，李艷芳，史淑紅，

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊 050000)

莪術(shù)油是從姜科植物莪術(shù)的干燥根莖中提取的揮發(fā)油成分，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛之功。莪術(shù)中富含揮發(fā)油，且成分相當復(fù)雜，主要化學(xué)成分為β-香烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)酮、新莪術(shù)二酮、樟腦和異莪術(shù)醇等［1］。其具有很好的抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓形成和增強免疫功能等［2-4］廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是其抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注。楊美春等［5］研究表明，莪術(shù)油對人卵巢癌SKOV3細胞具有增殖抑制作用。但對卵巢癌耐藥細胞株是否有作用目前尚未見報道。

信號傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)異常表達與腫瘤細胞的化療藥物有關(guān)，Rosen等［6］發(fā)現(xiàn)STAT3和Bcl-xl高表達的卵巢癌細胞系SKOV3對順鉑不敏感，而STAT3低表達的卵巢癌細胞系A(chǔ)2780對化療藥物敏感，實驗表明:腫瘤細胞中STAT3高表達于化療耐藥有關(guān)。Gu等［7］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中STAT3異常高表達與順鉑化療耐藥相關(guān)，并通過體外研究發(fā)現(xiàn)阻斷STAT3信號通路可恢復(fù)腫瘤細胞對順鉑化療的敏感性。抑制STAT3信號通路可以使耐藥腫瘤細胞增敏，STAT3通路及其調(diào)控的下游靶基因可以作為腫瘤對化療耐藥的標志［8-12］。實驗擬通過體外實驗將莪術(shù)油作用 SKOV3/DDP評估其抗腫瘤作用，并初步探討其對STAT3信號傳導(dǎo)通路的影響，為耐藥性卵巢癌的臨床治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人卵巢癌順鉑耐藥細胞系SKOV3/DDP購自上海生物工程公司。該細胞系耐藥倍數(shù)是親代株的4.3倍，此細胞系在加藥凍存及連續(xù)無藥培養(yǎng)條件下可分別保持3個月及6個月的穩(wěn)定耐藥性。

1.1.2 主要藥物及試劑 莪術(shù)油注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司，規(guī)格:10 mL/支:莪術(shù)油0.1 g/支，國藥準字H20067076);順鉑(山東齊魯制藥廠，規(guī)格:10 mg/支，國藥準字H37021358);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);Actived Caspase-3抗體、STAT3抗體、兔抗人Survivin抗體(Bioworld公司產(chǎn)品);山羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);噻唑藍(美國Sigma公司);RNA提取試劑盒(Invitrogen公司);引物(賽百盛公司)。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器公司);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);臺式離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司);酶標儀MN3型(Labsystems Dragon Well Scan);倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS);數(shù)碼相機(日本 OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將SKOV3/DDP細胞置于含10%胎牛血清、1μg/mL順鉑、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換液1次，約3～5 d經(jīng)0.4%胰蛋白酶消化以1∶3的比例傳代。順鉑用生理鹽水配成20μg/mL貯存液，－20℃保存，使用時需要用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成工作液。

莪術(shù)油作用于 SKOV3/DDP細胞的IC30為37μg/mL之間，順鉑作用于SKOV3/DDP細胞的IC30在10與20μg/mL之間，預(yù)實驗顯示莪術(shù)油與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同作用，依據(jù)文獻選用15μg/mL［13］。

1.2.2 MTT法測定SKOV3/DDP細胞的增殖活性

將細胞密度為5×104個/mL接種于96孔板，待細胞達到對數(shù)生長期后吸去培養(yǎng)液，分別加入含10%胎牛血清RPM11640配制的質(zhì)量濃度為0、16、32、64、128、256μg/mL 莪術(shù)油 0.2 mL/孔，各設(shè)3個復(fù)孔;分別培養(yǎng)24、48 h后棄上清，加入5 mg/mL的MTT(PBS液配制)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，各孔加入0.15 mL DMSO，振搖10 min，酶標儀490 nm處測定各孔吸光度D490的值，并記錄結(jié)果。實驗重復(fù)3次，計算實驗組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=［1－(實驗孔 D490值 －空白孔 D490值)/(對照孔D490值 －空白孔D490值)］×100%

1.2.3 免疫組化法 將蓋玻片放入12孔板中，然后將處于對數(shù)生長期的細胞，以5×104mL接種到12孔板中，待24 h細胞貼壁后，按15μg/mL順鉑、37μg/mL 莪術(shù)油、15μg/mL 順鉑聯(lián)合 37μg/mL莪術(shù)油加入到12孔板中，同時設(shè)空白對照。培養(yǎng)24 h后，丙酮固定30 min，實驗方法參考文獻［15］。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析400倍所拍的照片，分析前進行陽性目標的彩色分割、編輯，得到滿意圖形圖像后，選擇相應(yīng)的區(qū)域，測量其積分光密度(IOD)及測量面積，以IOD值除以測量面積，計算平均光密度(mean density)，高倍鏡下選取10個視野，每張片子計算10次平均光密度值。

1.2.4 RT-PCR檢測莪術(shù)油對SKOV3/DDP細胞STAT3及其下游靶基因的表達情況 參照NCBIGeneBank的基因序列，運用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物(見表1)。具體過程參考文獻［16］，擴增條件見表2，取5μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，UVP紫外凝膠分析系統(tǒng)攝像，利用Quantity one圖象分析軟件行灰度值分析并保存結(jié)果。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction conditions

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算P值。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，兩組以上均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析和非參數(shù)檢驗)，數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測莪術(shù)油對SKOV3/DDP細胞增殖抑制情況 實驗結(jié)果顯示16、32、64、128、256μg/mL莪術(shù)油作用于卵巢癌SKOV3/DDP細胞后，隨藥物質(zhì)量濃度增加，其對細胞有明顯的抑制作用且呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量關(guān)系。藥物作用24 h后，抑制率分別為 13.9%、24.6%、59.7%、86.0%、96.2%;作用 48h抑制率分別為21.77%、29.72%、49.04%、54.67%，統(tǒng)計結(jié)果顯示對照組與各質(zhì)量濃度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3、圖1。

表3 不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油對SKOV3/DDP的增殖抑制率()Tab.3 Inhibition rates of the different concentrations of Zedoary Oil to the SKOV3/DDP cells()

表3 不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油對SKOV3/DDP的增殖抑制率()Tab.3 Inhibition rates of the different concentrations of Zedoary Oil to the SKOV3/DDP cells()

注:不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油作用于SKOV3/DDP吸光度值比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

藥物質(zhì)量濃度/(μg·mL－1 24 h 48 h)光密度值 增殖抑制率 光密度值 增殖抑制率0(對照組)0.173±0.008 0.201±0.00716 0.160±0.002 0.139* 0.171±0.005 0.205*32 0.149±0.006 0.246* 0.152±0.003 0.336*64 0.116 ±0.004 0.597* 0.104 ±0.003 0.662＊＊128 0.091 ±0.004 0.860＊＊ 0.072 ±0.002 0.882＊＊256 0.082±0.003 0.962* 0.059±0.001 0.976*

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測細胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達情況 表4及圖3示，終質(zhì)量濃度為15μg/mL順鉑，39μg/mL莪術(shù)油，及其二者聯(lián)合作用于卵巢上皮細胞癌SKOV3/DPP檢測結(jié)果顯示STAT3各組的表達有差異，Survivin結(jié)果顯示各組間比較有差異，各組間表達有差異，Caspase-3各組間表達有區(qū)別。均為P＜0.01差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析SKOV3/DPP細胞中STAT3與Survivin蛋白的相關(guān)系數(shù)為0.883，P=0.000＜0.01，呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計學(xué)意義;STAT3與 Caspase-3蛋白的相關(guān)系數(shù)為 －0.878，P=0.000＜0.01，呈負相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油作用SKOV3/DDP 48 h后細胞形態(tài)變化(100×)Fig.1 Morphological changes of SKOV3/DDP cells after being treated with different concentrations of Zedoary Oil for 48 hours(100×)

圖2 莪術(shù)油、順鉑、莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用于SKOV3/DDP 24 h后STAT3，Survivin，Caspase-3免疫組化結(jié)果(400×)Fig.2 Expression of STAT3，Survivin，VEGFC，Caspase-3 protein in SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by immunohistochemistry

表4 SKOV3/DDP胞漿或胞核中STAT3，Survivin，Caspase-3蛋白表達()Tab.4 Expression of STAT3，Survivin protein in the cytoplasm and cell nuclear of SKOV3/DDP cells()

表4 SKOV3/DDP胞漿或胞核中STAT3，Survivin，Caspase-3蛋白表達()Tab.4 Expression of STAT3，Survivin protein in the cytoplasm and cell nuclear of SKOV3/DDP cells()

注:不同組別兩兩比較，＊＊P＜0.01

組 別平均光密度值空白對照組 15μg/mL順鉑 37μg/mL莪術(shù)油 順鉑+莪術(shù)油STAT3 1.057±0.130 0.781±0.078＊＊ 0.639±0.061＊＊ 0.117±0.019＊＊Survivin 1.008±0.125 0.771±0.119＊＊ 0.580±0.064＊＊ 0.139±0.044＊＊Caspase-3 0.338±0.050 0.593±0.069＊＊ 0.732±0.067＊＊ 0.905±0.097＊＊

2.3 RT-PCR檢測卵巢癌細胞相關(guān)蛋白表達變化情況 SKOV3/DDP細胞STAT3、Survivin表達量的變化:15μg/mL順鉑組STAT3 mRNA表達量與對照組比較吸光度比值有所下降，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);37μg/mL莪術(shù)油組 STAT3、Survivin表達量與對照組比較表達下降，差異有顯著性(P＜0.05)。莪術(shù)油 +順鉑組 SKOV3/DDP細胞的STAT3、Survivin與對照組比較明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)。聯(lián)合用藥與順鉑組、莪術(shù)油組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。15μg/mL順鉑組與37μg/mL莪術(shù)油組比較有差異，莪術(shù)油組抑制作用明顯，見圖3。

SKOV3/DDP細胞Caspase-3 mRNA表達量的變化:15μg/mL順鉑組STAT3 mRNA表達量與對照組比較吸光度比值增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);37μg/mL莪術(shù)油組Caspase-3 mRNA表達量與對照組比較表達上調(diào)，差異有顯著性(P＜0.05)。莪術(shù)油 +順鉑組 SKOV3/DDP細胞的Caspase-3 mRNA與對照組比較明顯增強，差異有顯著性(P＜0.05)。聯(lián)合用藥與順鉑組、莪術(shù)油組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。15μg/mL順鉑組與37μg/mL莪術(shù)油組比較有差異，莪術(shù)油組抑制作用明顯，見圖3。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析SKOV3/DPP細胞中STAT3與Survivin蛋白的相關(guān)系數(shù)為0.836，P=0.000＜0.01，呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計學(xué)意義;STAT3與 Caspase-3蛋白的相關(guān)系數(shù)為 －0.857，P=0.000＜0.01，呈負相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 RT-PCR技術(shù)檢測莪術(shù)油，順鉑及其二者聯(lián)合作用SKOV3/DDP細胞STAT3 Survivin，Caspase-3 mRNA的表達Tab.5 Expression of STAT3，Survivin Caspase-3 mRNA in the SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR()

表5 RT-PCR技術(shù)檢測莪術(shù)油，順鉑及其二者聯(lián)合作用SKOV3/DDP細胞STAT3 Survivin，Caspase-3 mRNA的表達Tab.5 Expression of STAT3，Survivin Caspase-3 mRNA in the SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR()

注:不同組別間兩兩比較，＊＊P＜0.01

組 別平均光密度值空白對照組 15μg/mL順鉑 37μg/mL莪術(shù)油 順鉑+莪術(shù)油STAT3 0.913±0.089 0.835±0.021＊＊ 0.723±0.050＊＊ 0.597±0.025＊＊Survivin 0.850±0.064 0.841±0.032＊＊ 0.723±0.050＊＊ 0.572±0.049＊＊Caspase 0.505±0.015 0.586±0.034＊＊ 0.633±0.047＊＊ 0.808±0.044＊＊

圖3 RT-PCR檢測莪術(shù)油、順鉑、莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用于 SKOV3/DDP 24 h 后 STAT3，Survivin，Caspase-3表達情況Fig.3 Expression ofSTAT3， Survivin， VEGFC，Caspase-3 mRNA in SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，死亡率高，五年生存率僅20%～30%。由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀多為晚期。目前，卵巢癌的治療方法主要是腫瘤細胞減滅術(shù)及術(shù)后正規(guī)足量聯(lián)合化療，可明顯提高患者帶瘤生存率。受經(jīng)濟條件的限制，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療仍是部分患者首選的化療藥物，但在化療過程中患者表現(xiàn)出不同程度的獲得性耐藥及嚴重的毒副作用，是導(dǎo)致卵巢癌化療耐藥、未控的重要因素。延長生存時間，提高患者的生存質(zhì)量，尋找低毒、高效的抗腫瘤藥物一直以來是廣大學(xué)者研究的熱點。

天然中藥低毒、高效，具有獨特的優(yōu)勢。研究證實莪術(shù)油不僅能直接抑制、破壞腫瘤細胞，還可誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、增強機體自身的免疫功能［17］，能較好地直接干預(yù)或輔助治療惡性腫瘤［2］。實驗通過顯微鏡，MTT實驗證實莪術(shù)油對SKOV3/DDP細胞增殖具有抑制作用。流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油聯(lián)合順鉑所用于SKOV3/DDP細胞后，細胞凋亡率明顯增高，但其逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)機制尚無研究報道。

本實驗以SKOV3/DDP細胞作為研究對象，利用MTT法觀察不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油對細胞增殖的影響。為進一步了解其對STAT3信號通路的影響，初步探討可能作用機制，采用免疫組織化學(xué)法，RT-PCR法檢測莪術(shù)油對STAT3信號通路及下游靶基因相關(guān)蛋白表達的影響，同時采用順鉑、莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用于SKOV3/DDP細胞后觀察莪術(shù)油對SKOV3/DDP細胞中STAT3信號通路及下游靶基因相關(guān)蛋白影響。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌順鉑耐藥細胞SKOV3/DDP細胞中STAT3，Survivin表達增高，Caspase-3表達下調(diào)。莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用SKOV3/DDP細胞后細胞增殖抑制作用較莪術(shù)油單獨使用更加明顯。RT-PCR結(jié)果顯示順鉑，莪術(shù)油及其聯(lián)合作用于細胞SKOV3/DDP后各組間STAT3、Survivin蛋白的表達具有明顯差異，且P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時統(tǒng)計結(jié)果顯示STAT3的表達與Survivin呈正相關(guān)關(guān)系，與Caspase呈負相關(guān)關(guān)系，P＜0.01差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。莪術(shù)油與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同或疊加增敏作用。本實驗結(jié)果顯示莪術(shù)油對SKOV3/DDP細胞的增值抑制作用可能影響STAT3信號傳導(dǎo)通路及其下游靶基因蛋白的表達。

正常情況下STAT3蛋白的激活快速而短暫，腫瘤組織中STAT3持續(xù)激活從而導(dǎo)致其下游靶基因的異常激活，下游靶基因如Survivin、caspases、cmyc等均已證實與細胞增殖、分化、惡性轉(zhuǎn)化、凋亡抑制等病理生理過程密切相關(guān)［18］。Gu等［7］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中STAT3高表達與順鉑耐藥相關(guān)，并進一步研究發(fā)現(xiàn)通過阻斷STAT3信號通路可恢復(fù)腫瘤細胞對順鉑的敏感性。Survivin作為凋亡抑制基因，幾乎在所有的惡性腫瘤中均有表達，其過量表達與腫瘤耐藥有關(guān)［19］，化療藥物可通過誘導(dǎo)Survivin的表達上凋，上調(diào)的Survivin可與Caspases特異性結(jié)合，抑制Caspase-3和Caspase-7的活性從而阻斷多種凋亡信號誘導(dǎo)細胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤耐藥的形成［20］。實驗結(jié)果與上述報道一致。

實驗研究顯示，莪術(shù)油對人卵巢癌順鉑耐藥細胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用;莪術(shù)油作用于SKOV3/DDP細胞后，STAT3及其下游靶基因表達Survivin、Caspase-3表達降低從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥細胞的耐藥性。莪術(shù)油可增強SKOV3/DDP對順鉑敏感性，其相關(guān)機制可能與STAT3信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，但仍需進一步深入臨床研究。

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