湯 浩，劉曉莉，王 銳，高慶劍，陸 鋮，孫志博

(1.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州 730000;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系，寧夏銀川 750000;3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳所，甘肅蘭州 730000)

人體內(nèi)主要藥物代謝酶是細(xì)胞色素P450家族，其中CYP1A1、CYP3A4是主要的誘導(dǎo)酶，前者能催化許多前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物［1］，后者代謝60%臨床常用藥物［2］，它們是藥物代謝/毒理學(xué)的重要指標(biāo)。齊墩果酸臨床上主要用于治療急性黃疸型和慢性中毒性肝炎，并作為抗癌輔助藥物。經(jīng)研究齊墩果酸具有保肝作用［3-4］，并且能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的凋亡［5］。綠原酸具有廣泛的藥理和生理活性，主要存在于杜仲，金銀花等植物中。有文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸具有抗肝纖維化和肝損傷的作用［6］，綠原酸對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［7］，利福平是肝臟CYP450酶某些同工酶的誘導(dǎo)劑和抑制劑，影響其他藥物代謝［8］。因此本實(shí)驗(yàn)選取齊墩果酸和綠原酸為研究對(duì)象，探討它們對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、CYP1A1mRNA、CYP3A4 mRNA的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 齊墩果酸和綠原酸均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供定量測(cè)定用。利福平(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。采用二甲基亞砜(DMSO)助溶，DMSO在細(xì)胞液中的終濃度不超過(guò)0.1%。TaKaRa RNAiso Plus購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Rever Ace qPCR RT Master Mix購(gòu)自TOYOBO公司;實(shí)驗(yàn)所用引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，委托上海生工合成;新生牛血清購(gòu)自PAA公司;噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó) Sigma公司)。一次性細(xì)胞瓶(5×5 cm2)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(100 mm)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板全部購(gòu)自NUNC公司。

1.2 儀器 超凈臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱，ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR，梯度 PCR測(cè)定儀(購(gòu)自 PCR公司)，高速低溫離心機(jī)(SIGMA公司)，核酸蛋白測(cè)定儀。

1.3 HepG2 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞HepG2為本實(shí)驗(yàn)室保存。HepG2接種于含10%新生牛血清、抗生素(100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境:5%CO2、37℃、相對(duì)濕度90%。HepG2細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，100μL/孔，16 h后加入含不同質(zhì)量濃度齊墩果酸、綠原酸和利福平的培養(yǎng)基，藥物終質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和正常細(xì)胞生長(zhǎng)組，藥物作用24 h后，加入5 mg/mL MTT，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO 150μL/孔溶解，震蕩混勻10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析儀上測(cè)定A490nm值。按以下公式計(jì)算藥物細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，實(shí)驗(yàn)以3次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為最終結(jié)果。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1－A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照)×100%

1.5 細(xì)胞周期測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×106個(gè)/瓶接種于一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)16 h后，用PBS清洗兩遍，加入含不同質(zhì)量濃度藥物齊墩果酸和綠原酸的培養(yǎng)基，藥物質(zhì)量濃度分別為100、50、25μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照利福平 10μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞液，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入300μL PBS，再加入 －20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇 700μL，混勻，－20℃冰箱固定24 h以上，離心洗滌細(xì)胞后，加入終質(zhì)量濃度20μg/mL的RNA酶，置于37℃水浴30 min，接著加入50μg/mL PI 300μL避光染色30 min，300目篩網(wǎng)過(guò)濾，2 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.6 齊墩果酸和綠原酸對(duì)HepG2細(xì)胞中CYP1A1、CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響

1.6.1 分組 實(shí)驗(yàn)組，齊墩果酸和綠原酸質(zhì)量濃度為100、50、25μg/mL;陰性對(duì)照組，正常細(xì)胞生長(zhǎng)組，陽(yáng)性對(duì)照利福平10μg/mL。

1.6.2 RNA的提取和cDNA的合成 細(xì)胞接種于一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶，16 h后吸取舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，加入含不同質(zhì)量濃度兩種藥物的培養(yǎng)基，藥物作用時(shí)間為24 h。用RNAiso Plus試劑盒提取RNA之后，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)A260/A280比值，鑒定 RNA的純度。RNA溶解于15μL RNse-free H2O中，5μL用于測(cè)定 RNA的純度，8μL用于反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為5×RT Master Mix 2μL，RNA 溶解液 8μL，反轉(zhuǎn)錄總體積 10μL。反轉(zhuǎn)錄的條件為37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃5 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4℃保存。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng) 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10倍稀釋后作為PCR反應(yīng)模板，PCR的反應(yīng)體系為:1μL稀釋液，上下游引物 10μmol/L(表 1)各1μL，2×SYBR Green I 12.5μL，添加高壓滅菌的三蒸水至終體積25μL，混勻。反應(yīng)條件:起始95℃ 5 min，擴(kuò)增時(shí)95℃ 15 s，60℃15 s，72℃45 s循環(huán)40次，溶解曲線分析。以GADPH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量分析。

實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)采用比較閾值法進(jìn)行相對(duì)定量分析。計(jì)算方法:目的基因誘導(dǎo)或抑制倍數(shù)=2－ΔΔCt，Ct值是熱循環(huán)儀中熒光達(dá)到閾值循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt(目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct)－對(duì)照組ΔCt(目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct)。計(jì)算每一個(gè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物Tab.1 Sequence of primer used in real-time PCR

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用“”表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸和綠原酸對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著齊墩果酸和綠原酸質(zhì)量濃度的增大，對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率明顯升高，并且具有明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。質(zhì)量濃度低于50μg/mL時(shí)，綠原酸對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用比齊墩果酸強(qiáng)，但質(zhì)量濃度高于50μg/mL，齊墩果酸對(duì)HepG2的抑制作用明顯高于綠原酸。在50μg/mL時(shí)，兩種藥物的抑制率相同。利福平6.25～200μg/mL對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用都在40%左右，抑制作用較強(qiáng)。在下述細(xì)胞周期和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中選擇藥物處理質(zhì)量濃度為100、50和25μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照利福平10μg/mL。觀察齊墩果酸、綠原酸和利福平對(duì)HepG2細(xì)胞周期和CYP1A1 mRNA、CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響。見(jiàn)圖1。

圖1 齊墩果酸、綠原酸和利福平對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and rifampicin on proliferation of HepG2 cells

2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定3種質(zhì)量濃度齊墩果酸和綠原酸對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 經(jīng)3種藥物不同質(zhì)量濃度藥物處理后，HepG2細(xì)胞各時(shí)期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比與正常對(duì)照組相比較，有些細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯變化。齊墩果酸25μg/mL和綠原酸 50、25μg/mL、陽(yáng)性對(duì)照利福平 10μg/mL均對(duì)細(xì)胞周期沒(méi)有明顯影響。齊墩果酸的100、50μg/mL 和綠原酸的100μg/mL 均對(duì)HepG2細(xì)胞周期S期發(fā)生了明顯阻滯。見(jiàn)圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度齊墩果酸、綠原酸對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響Fig.2 Different concentrations of oleanlic acid and chlorogenic on the cell cycle of HepG2 cells

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)兩種藥物不同質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞中CYP1A1 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，齊墩果酸在3個(gè)質(zhì)量濃度均可明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中CYP1A1 mRNA表達(dá)，給藥質(zhì)量濃度從大到小誘導(dǎo)倍數(shù)依次為2.48、1.45、2.34。綠原酸3個(gè)質(zhì)量濃度均可明顯抑制HepG2細(xì)胞中CYP1A1 mRNA表達(dá)，給藥質(zhì)量濃度從大到小抑制倍數(shù)依次為1.91、0.61、2.82，陽(yáng)性對(duì)照利福平10μg/mL的誘導(dǎo)倍數(shù)為2.3相對(duì)較弱。見(jiàn)圖3。

圖3 齊墩果酸、綠原酸和利福平對(duì)HepG2細(xì)胞CYP1A1 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and rifampicin on the expression of in CYP1A1 mRNA HepG2 cells

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)兩種藥物不同質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，齊墩果酸在3個(gè)質(zhì)量濃度均可明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)，給藥質(zhì)量濃度從大到小誘導(dǎo)倍數(shù)依次為1.17、2.42、8.40。綠原酸 100、50μg/mL均可抑制 HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)，抑制倍數(shù)依次為 0.65、1.00，綠原酸 25μg/mL HepG2細(xì)胞中 CYP3A4 mRNA表達(dá)可明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)倍數(shù)為0.59，誘導(dǎo)相對(duì)較弱，陽(yáng)性對(duì)照利福平10μg/mL能顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)能力較強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

3 討論

藥物代謝酶在藥物的代謝解毒和代謝活化中起著重要的作用［9］。研究中藥成分對(duì) CYP的影響，為預(yù)測(cè)有關(guān)中西藥之間相互作用，提高中藥有效成分的有效性和安全性具有重要意義。

圖4 齊墩果酸、綠原酸和利福平對(duì)HepG2細(xì)胞CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of oleanolic acid and chlorogenic acid and rifampicin on theexpression ofin CYP3A4 mRNA cells HepG2

齊墩果酸和綠原酸是一種天然藥物，國(guó)內(nèi)對(duì)其提取分離及藥理作用研究較多，但很多作用機(jī)制尚處于研究探索階段［10］。因此，進(jìn)一步研究?jī)煞N藥物抗腫瘤機(jī)理及其藥物的體外代謝，顯得很有意義。HepG2細(xì)胞具有典型肝癌細(xì)胞的一系列惡性特征，最大的優(yōu)點(diǎn)是保留了一系列生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的Ⅰ相和Ⅱ相酶，是研究和評(píng)價(jià)防治肝癌藥物的較理想細(xì)胞模型。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，200～6.25μg/mL齊墩果酸和綠原酸均可抑制肝癌細(xì)胞 HepG2生長(zhǎng)，50μg/mL時(shí)，兩種藥物的抑制率相同，說(shuō)明齊墩果酸和綠原酸是潛在防治肝癌的中藥制劑，利福平在一定范圍能顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞周期在腫瘤的生長(zhǎng)調(diào)控中具有重要的作用，通過(guò)改變細(xì)胞周期來(lái)阻止腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖已受到人們的關(guān)注［11］。細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在2個(gè)重要階段:G1-S期和G2-M期。齊墩果酸和綠原酸的有效質(zhì)量濃度處理HepG2細(xì)胞，使S期細(xì)胞顯著降低，兩種藥物有可能通過(guò)影響細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

近年來(lái)認(rèn)為CYP1A1活化苯并芘等多種多環(huán)芳烴化合物使其致癌［12］，并且CYP1A1的誘導(dǎo)能力是作為評(píng)價(jià)致癌性的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和綠原酸的三個(gè)有效質(zhì)量濃度均能誘導(dǎo)的CYP1A1 mRNA表達(dá)，由于齊墩果酸和綠原酸對(duì)CYP1A1的誘導(dǎo)是否可能增加機(jī)體對(duì)毒性物質(zhì)代謝發(fā)生變化，對(duì)機(jī)體造成一定的損害，長(zhǎng)期服用含齊墩果酸和綠原酸的藥物是否對(duì)機(jī)體有潛在的毒副作用，對(duì)藥物代謝性相互作用的影響，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

CYP3A4可同時(shí)氧化代謝多種藥物，導(dǎo)致藥效的增強(qiáng)(降低)或毒副作用的增加［13］。由于其代謝的廣泛性，進(jìn)一步影響了藥物的藥效學(xué)和毒理學(xué)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，齊墩果酸高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度是CYP3A4的誘導(dǎo)劑，而綠原酸的低質(zhì)量濃度是CYP3A4的抑制劑，兩種藥物與其他藥物合用時(shí)，能夠影響其他藥物的血藥濃度和生物利用度，對(duì)藥物相互性作用的影響有待于進(jìn)一步研究，利福平是肝癌細(xì)胞的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［4-15］，齊墩果酸能抑制肝癌細(xì)胞SMC-7721、Hep3B的增殖和誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分析了齊墩果酸和綠原酸對(duì)HepG2細(xì)胞周期和兩種CYP450酶的誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明齊墩果酸和綠原酸對(duì)CYP450酶系的誘導(dǎo)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中西藥代謝相關(guān)性提供了體外實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)支持。兩種藥物體內(nèi)是否也存在CYP450酶的誘導(dǎo)或者抑制作用，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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