潘曉麗，向 暉，謝運飛，章從恩，董小萍

(成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川成都 611137)

自Rosenberg［1］發(fā)現(xiàn)順鉑的抗癌活性以來，無機成分中金屬元素的藥理活性日益受到人們的關(guān)注，基于金屬配合物的藥物研究得到了迅速發(fā)展［2］。許多事實證明，中藥中無機元素具有重要的藥理作用及活性，對于發(fā)揮中藥的療效有著十分重要的作用，中藥有效成分往往不單純是有機成分，而多是由有機成分和金屬元素組成的配合物［3］。金屬離子與中藥化學成分形成配合物后往往改變或增強其活性，例如抗菌、抗腫瘤、抗氧化等［4］。將中藥有效成分與金屬離子進行配合發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，是提高中藥化學成分活性的有效途徑［5-6］。

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌)由于其結(jié)構(gòu)中有相鄰的羰基和羥基，能與金屬離子形成配合物。唐睿等［7］采用ICP-AES法測定了大黃中5種微量元素(鎂、鐵、錳、鋅、銅)的量，結(jié)果表明大黃生藥中鎂的量最高。本實驗通過合成大黃素-鎂(Ⅱ)金屬配合物，研究其可能的配位結(jié)構(gòu)及抗氧化活性，可以從一個嶄新的角度探索中藥新藥的開發(fā)方法，具有很大的研究意義。

1 試劑與儀器

核磁共振氫譜采用BRUKER AM—400型超導(dǎo)核磁共振儀(DMSO-d6作溶劑測定);紅外光譜采用BRUKER Tensor-27型傅立葉變換中紅外光譜儀測定;UV—1700型紫外分光光度計;PH計采用PHB—8型PH計。

大黃素(成都康邦生物生物科技有限公司，純度大于98.5%);二苯代苦味肼基自由基(DPPH·，美國Sigma公司)，羥甲基氨基甲烷(tris，美國Sigma公司)、N-甲基吩嗪甲基硫酸鹽(PMS，美國Sigma公司)，還原性輔酶I二鈉鹽(NADHNa2，美國Sigma公司)，氯化硝基四氮唑藍(NBT，美國Sigma公司)，C4H6O4Mg·4H2O，無水乙醇，無水甲醇等試劑為國產(chǎn)分析純，實驗用水為離子交換蒸餾水。

2 配合物的合成［8］

稱取1 mmoL大黃素(270 mg)溶于60 mL無水乙醇，40℃電磁攪拌，待大部分配體溶解后得黃色澄清溶液，加入0.5 mmoL(107.23 mg)C4H6O4Mg·4H2O(醋酸鎂)的15 mL無水乙醇溶液，逐滴加入氨水的乙醇溶液(1∶1，V∶V)，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至9.5，溶液很快有橙紅色沉淀生成，繼續(xù)以反應(yīng)溫度為40℃攪拌反應(yīng)12 h，將溶液靜置過夜真空抽濾，依次用無水乙醇及乙醚分別將沉淀洗滌數(shù)次后，真空干燥72 h，得粉末狀固體產(chǎn)物。

3 配合物的EDTA滴定

稱取大黃素-鎂配合物約60 mg(記為m)，在900℃馬弗爐中灼燒8 h至恒重得氧化鎂粉末，以稀硫酸溶解，加入pH=10的氨-氯化銨緩沖液5 mL，鉻黑T指示劑0.02 g，加入1∶1氨水數(shù)滴至產(chǎn)生白色氫氧化鎂沉淀，加水50 mL。以標定后的EDTA(Cedta)滴定，記下消耗的EDTA體積數(shù)(Vedta)。同時做空白實驗，其中金屬鎂含量計算公式為:

4 抗氧化活性實驗

4.1 配合物對DPPH·自由基的清除作用 取1 mL試樣與3 mL的8 mg/L DPPH無水甲醇溶液混均勻，暗室條件下反應(yīng)30 min，于517 nm［9］處測定吸光度(A樣)。以1 mL甲醇代替試樣按照上述步驟進行反應(yīng)，測定空白吸光度(A0)。

4.2 配合物對O2－·自由基的清除作用 由NADH/PMS體系產(chǎn)生［10］，本實驗對其略作修改。反應(yīng)體系為Tris-HCl溶液(0.05 mol/L，pH=8)，其中含有 10μmol/L PMS，50μmol/L NADHNa2，25μmol/L NBT，以及不同質(zhì)量濃度的1 mL試樣(分別取0.4 mg/L，0.2 mg/L，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.025 mg/L)。室溫反應(yīng)5 min后，在386 nm波長處測定吸光值(A樣)，1 mL蒸餾水代替試樣按照上述步驟進行反應(yīng)，測定空白吸光度(A0)。

4.3 配合物對·OH自由基的清除作用 采用Fe2+-H2O2-亞甲藍體系［11］，在5 mL量瓶中依次加入1 mLTris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=8)，1.5 mL亞甲藍(0.02 g/L)，0.5 mL FeSO4溶液(2 mmol/L)，0.5 mL的0.5%H2O2溶液，以及不同質(zhì)量濃度的1 mL試樣(分別取0.4 mg/L，0.2 mg/L，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.025 mg/L)，蒸餾水稀釋至刻度，40℃水浴中加熱反應(yīng)60 min，1 mL蒸餾水代替試樣按照上述步驟進行反應(yīng)，測定空白吸光度(A0)。

以上自由基清除率計算公式為:清除率=［(A0－A樣)/A0］×100%

5 結(jié)果與討論

5.1 配合物的紫外光譜 將大黃素和大黃素-鎂(Ⅱ)配合物配成質(zhì)量濃度為2.0×10－5mol/L的無水甲醇溶液，在200～500 nm范圍內(nèi)進行UV-vis掃描分別得吸收光譜(見表1)。比較大黃素和大黃素-鎂(Ⅱ)配合物紫外吸收光譜可知，大黃素在219、253、289 nm處出現(xiàn)三個比較強吸收帶，是苯環(huán)共軛體系、醌樣結(jié)構(gòu)譜帶，大黃素-鎂在223、264、293 nm處出現(xiàn)吸收帶，吸收峰位置發(fā)生一定程度移位，吸收強度減弱;大黃素在438 nm出現(xiàn)醌羰基吸收帶，而大黃素-鎂(Ⅱ)配合物在461 nm處出現(xiàn)吸收峰，比大黃素吸收帶紅移。峰位移動的原因可能是:大黃素與金屬離子形成配合物后，整個分子中電子的離域程度增大，致使電子躍遷時需要的能量降低，使吸收峰發(fā)生紅移。

表1 大黃素及大黃素-鎂(Ⅱ)的UV(nm)主要數(shù)據(jù)

5.2 配合物的紅外光譜 大黃素與大黃素-鎂(Ⅱ)配合物的紅外光譜主要特征峰(見表2)。配合物中原配體的特征峰1871 cm－1消失，同時配體在1624 cm－1(ν==C O)處的強吸收移至配合物的1601 cm(ν==C O)，說明羰基氧與鎂配位;配體中酚羥基的伸縮振動的吸收峰3475 cm－1在配合物中顯著減弱，說明酚羥基與鎂配位。同時在592 nm－1出現(xiàn)了系Mg—O伸縮振動的吸收峰［12］，進一步說明配合物的形成。

表2 大黃素及大黃素-鎂(Ⅱ)的IR(cm－1)主要數(shù)據(jù)

5.3 配合物的核磁共振氫譜 大黃素-鎂配合物的1H NMR(見表3)。δ 12.0～14(m，2H)出現(xiàn)一極弱多重峰，δ5.76～7.72(m，8H)出現(xiàn)一多重寬峰?？紤]到大黃素的1，8位酚羥基性質(zhì)相似，均可與9位羰基氧形成分子內(nèi)氫鍵，由于3位羥基的給電子共軛效應(yīng)及6位甲基的給電子誘導(dǎo)效應(yīng)影響差異，可推測8位羥基易于解離。因此推測，配體分子中的8位酚羥基失去質(zhì)子并通過9位氧原子與金屬離子形成配合物。

5.4 配合物的EDTA滴定結(jié)果 配合物中鎂離子測定結(jié)果為4.26%，理論值為4.27%。制得的大黃素-鎂配合物為兩分子大黃素與一分子鎂離子結(jié)合形成，實測值與理論值基本符合。結(jié)合上述分析結(jié)果，認為大黃素-鎂(Ⅱ)配合物的可能結(jié)構(gòu)見結(jié)構(gòu)圖1。

表3 大黃素及大黃素-鎂(Ⅱ)的1H NMR的數(shù)據(jù)(DMSO)

5.5 配合物的抗氧化活性

圖1 大黃素-鎂Ⅱ配合物結(jié)構(gòu)圖

5.5.1 配合物對DPPH·自由基的清除作用 配合物和配體清除DPPH·自由基的結(jié)果見圖2，由圖可知，大黃素和大黃素-鎂均具有一定抗DPPH·自由基活性，且配合物的活性明顯比相同量的配體大黃素高，但抑制率不高，分析原因有可能是實驗在甲醇中進行，大黃素-鎂配合物在甲醇中比較穩(wěn)定，不易形成穩(wěn)定的自由基中間體。

圖2 大黃素-Mg配合物及配體清除DPPH自由基活性

5.5.3 配合物對·OH自由基的清除作用 配合物和配體清除·OH自由基的結(jié)果見圖4，由圖可知，鎂配合物和配體大黃素均具有抗·OH自由基活性，相同濃度的鎂配合物抗·OH自由基活性較高，明顯高于配體大黃素，表明配體大黃素和鎂離子產(chǎn)生了協(xié)同作用，提高了其抗·OH的生物活性。

6 結(jié)論

圖3 大黃素-Mg配合物及配體清除·自由基活性

圖4 大黃素-Mg配合物及配體清除·OH自由基活性

本實驗以大黃素為配體合成了大黃素-Mg配合物，利用核磁共振氫譜，紫外光譜，紅外光譜，配位滴定等方法對其結(jié)構(gòu)進行了表征，確定了配合物的可能組成。本實驗對比了大黃素與大黃素-Mg配合物對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基等三種自由基的清除率，結(jié)果證明，大黃素-Mg配合物的抗氧化活性相對于配體大黃素有顯著提高，表明有可能是配體與金屬離子之間存在協(xié)同抗氧化作用。但由于配合物一分子含有兩分子大黃素配體，增加了酚羥基的數(shù)目，有實驗證明酚類物質(zhì)的抗氧化性很多時候與酚羥基的數(shù)目及位置有關(guān)［13-15］，故具體的構(gòu)效關(guān)系還有待于進一步研究。

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