馬迪，陳超，吳薇，游艷，潘宜云，盛夢(mèng)婷，朱峰，何治

隨著當(dāng)今世界人口老齡化的日益嚴(yán)重，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率日趨增高，迫切需要尋找新的有效藥物[1]?！稏|北藥植志》記載：香椿子性溫、味辛苦、無(wú)毒，入肝、肺經(jīng)，具祛風(fēng)、散寒、止痛之功效[2]。在三峽地區(qū)民間，有人在庫(kù)區(qū)采集香椿子并用其泡水或煎服用來(lái)治療腦血栓、腦栓塞等血栓性疾病，尤其對(duì)腦梗死偏癱患者的恢復(fù)治療有較好療效。本課題組前期已經(jīng)對(duì)香椿子揮發(fā)油成分[3]治療血栓栓塞性疾病的作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)香椿子提取物具有較好的抗凝血、抑制血栓形成和提高纖溶活性等作用。另外，我們前期研究表明，香椿子提取物能有效降低心肌梗死模型大鼠心肌梗死面積，且該效應(yīng)與香椿子提取物抑制氧化應(yīng)激及血栓形成有關(guān)[4-5]。本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討香椿子正丁醇提取物(n-Butanol extract，n-BuE)的抗腦缺血作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 n-BuE的制備由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，用2% Tween 80作為溶劑溶解，配制成所需濃度。Tween80購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；阿司匹林購(gòu)自河北常山生化藥業(yè)有限公司；硝普鈉購(gòu)自悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司；水合氯醛購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)、BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性昆明種小鼠42只，體重18～27g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：00015672)。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組7只：①假手術(shù)組；②缺血再灌注組；③溶媒組(2% Tween80)；④n-BuE低劑量治療組[28mg/(kg.d)]；⑤n-BuE高劑量治療組[42mg/(kg.d)]；⑥陽(yáng)性對(duì)照組[阿司匹林14mg/(kg.d)]。

1.3 模型制備及給藥 缺血再灌注(I-R)模型制作方法：術(shù)前12h禁食不禁水，水合氯醛(10%水合氯醛按0.035ml/10g體重)腹腔注射麻醉后，將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上；消毒后沿頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾結(jié)扎阻斷CCA；20min后再灌注10min，如此反復(fù)2次，第1次缺血前腹腔注射硝普鈉[2.5mg/(kg.d)]。術(shù)中保持動(dòng)物肛溫37±0.5℃。給藥方法均為灌胃，溶媒組小鼠灌服7ml/kg劑量的2% Tween80，n-BuE低、高劑量治療組小鼠分別灌服相應(yīng)劑量的n-BuE，陽(yáng)性對(duì)照組灌服相應(yīng)劑量的阿司匹林；每天給藥1次，連續(xù)給藥7d，各組行腦缺血再灌注手術(shù)。

1.4 腦組織含水量測(cè)定 術(shù)后6h用10%水合氯醛(0.035ml/10g)重新麻醉大鼠，斷頭取腦，去除小腦和低位腦干、嗅球，立即稱濕重，然后將腦組織烘干(105℃，24h)，再次稱重，按照干濕重法求出腦組織含水量。腦組織含水量按如下公式計(jì)算：腦組織含水量(%)=(腦濕重－腦干重)/腦濕重×100%。

1.5 血腦屏障通透性測(cè)定 小鼠腦缺血/再灌注損傷后血腦屏障的通透性可用腦組織中伊文思藍(lán)(EB)的含量來(lái)評(píng)價(jià)。手術(shù)6h后，小鼠尾靜脈注射2%EB(3ml/kg)。30min后小鼠用10%水合氯醛[350mg/(kg.d)]腹膜內(nèi)注射麻醉，開(kāi)胸，用生理鹽水0.25L/kg灌注升主動(dòng)脈，斷頭取腦，稱濕重后放入裝有0.5ml 1mol/L KOH溶液的容器中，37℃過(guò)夜，用1mol/L H3PO4溶液0.75ml中和堿性，然后加入2.25ml丙酮，于3500g離心3次，每次15min。取上清液于λ=620nm測(cè)定吸光度(A)值。根據(jù)以上工作條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每1g腦組織中EB的含量。

1.6 MDA、NO含量及SOD、GSH-Px活力測(cè)定 術(shù)后6h用10%水合氯醛 (0.035ml/10g)重新麻醉大鼠，斷頭取腦，將左右皮層與海馬分離，去除小腦和低位腦干、嗅球，其余操作均按照南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 n-BuE對(duì)腦缺血再灌注小鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性的影響 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組腦組織含水量、伊文思藍(lán)含量均明顯升高(P＜0.01)。溶媒組與缺血再灌注組比較，腦組織含水量、伊文思藍(lán)含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明用于溶解n-BuE的溶媒不影響藥物的治療效果。與缺血再灌注組比較，陽(yáng)性對(duì)照組的腦組織含水量、伊文思藍(lán)含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，而阿司匹林已被證實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠腦缺血模型有神經(jīng)保護(hù)作用，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用模型穩(wěn)定可靠。與缺血再灌注組比較，n-BuE[28mg/(kg.d)，42mg/(kg.d)]治療組的腦組織含水量、伊文思藍(lán)含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01，表1)。

2.2 n-BuE對(duì)腦缺血再灌注小鼠皮層和海馬MDA、NO含量及SOD、GSH-Px活力的影響 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組海馬組織MDA、NO含量明顯增加(P＜0.01)，且海馬組織SOD活性、GSH-Px活力明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。溶媒組與缺血再灌注組比較，海馬組織MDA、NO含量及SOD活性、GSH-Px活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明用于溶解n-BuE的溶媒不影響藥物的治療效果。與缺血再灌注組比較，陽(yáng)性對(duì)照組海馬組織的MDA、NO含量明顯降低(P＜0.01)，且海馬組織SOD活性、GPX-Px活力明顯抑制(P＜0.01)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用模型穩(wěn)定可靠。與缺血再灌注組比較，n-BuE[28mg/(kg.d)，42mg/(kg.d)]治療組海馬組織MDA、NO含量明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)，且SOD活性、GPX-Px活力明顯抑制(P＜0.01，表2)。

表1 n-BuE對(duì)腦I-R小鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性的影響 , n=7)Tab. 1 Effects of n-BuE of Chinese toon seeds on the water extent of brain and the permeability of the blood brain barrier, n=7)

表1 n-BuE對(duì)腦I-R小鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性的影響 , n=7)Tab. 1 Effects of n-BuE of Chinese toon seeds on the water extent of brain and the permeability of the blood brain barrier, n=7)

EB content(μg/g)Sham-operated group 75.35±0.59 13.59±2.18 Ischemia-reperfusion model 87.56±6.44(1)45.38±5.32(1)Vehicle control (2% Tween80) 88.15±10.47(1)42.22±9.88(1)Treatment group [28mg/(kg.d) n-BuE]83.08±7.53(2)39.25±1.21(2)Treatment group [42mg/(kg.d) n-BuE]78.52±5.21(3)25.36±0.89(3)Positive control [aspirin 14mg/(kg.d)]80.47±9.27(3)27.36±2.33(3)(1)P＜0.01 compared with sham-operated group; (2)P＜0.05,(3)P＜0.01 compared with ischemia-reperfusion model group; I-R.Ischemia-reperfusion; n-BuE. n-Butanol extract; EB. Evans blue

3 討 論

缺血性腦血管疾病常導(dǎo)致血腦屏障受損和破壞，從而伴發(fā)腦水腫，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示n-BuE可降低腦缺血再灌注小鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性，對(duì)腦缺血再灌注小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。腦缺血時(shí)的病理?yè)p害涉及的病理生理變化較復(fù)雜，包括多個(gè)方面，氧自由基損害[6]是目前廣泛認(rèn)可的機(jī)制之一。缺血性腦損傷后，自由基生成增多，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平急劇增加，并伴隨SOD、GSHPx活力的升高。SOD、GSH-Px是機(jī)體對(duì)抗自由基引起組織細(xì)胞破壞的主要防御工具。輕微的腦缺血損傷可引起SOD、GSH-Px基因表達(dá)的增加，并對(duì)隨后更為嚴(yán)重的缺血性腦損傷起到保護(hù)作用[5]，本實(shí)驗(yàn)中抗氧化酶活力的提升可能是損傷后自由基堆積，反饋引起SOD、GSH-Px基因表達(dá)增加，繼而導(dǎo)致抗氧化酶活力代償性升高。我們前期工作表明香椿子提取物在心肌缺血再灌注組織中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化作用，并且可有效降低心肌梗死模型大鼠的心肌梗死面積[4,7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明n-BuE能降低缺血大鼠腦內(nèi)MDA含量，抑制SOD、GSH-Px活力升高，對(duì)腦缺血再灌注小鼠表現(xiàn)出良好的抗氧化作用，推測(cè)n-BuE的抗氧化作用可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

表2 n-BuE對(duì)腦I-R小鼠海馬MDA、NO含量及SOD、GSH-Px活力的影響(s, n=7)Tab. 2 Effects of n-BuE of Chinese toon seeds on the contents of MDA and NO, and the activity of SOD and GSH-Px n=7)

表2 n-BuE對(duì)腦I-R小鼠海馬MDA、NO含量及SOD、GSH-Px活力的影響(s, n=7)Tab. 2 Effects of n-BuE of Chinese toon seeds on the contents of MDA and NO, and the activity of SOD and GSH-Px n=7)

(1)P＜0.01 compared with sham-operated group; (2)P＜0.05, (3)P＜0.01 compared with ischemia-reperfusion model group; I-R. Ischemiareperfusion; n-BuE. n-Butanol extract

Group MDA(nmol/mg) NO(mol/g) SOD(nU/mg) GSH-PX(U/mg)Sham-operated group 2.88±0.26 3.85±0.54 2.24±0.39 189.85±42.11 Ischemia-reperfusion model 4.45±0.63(1) 24.11±3.22(1) 10.18±2.15(1) 1927.62±401.27(1)Vehicle control (2% Tween 80) 4.77±1.23(1) 23.49±4.42(1) 9.49±2.58(1) 1979.11±100.79(1)Treatment group [28mg/(kg.d) n-BuE]3.95±0.18(2) 5.58±0.37(3) 4.11±0.87(3) 674.47±124.35(3)Treatment group [42mg/(kg.d) n-BuE]3.54±0.28(3) 3.12±0.48(3) 5.83±1.93(3) 722.28±189.04(3)Positive control [aspirin 14mg/(kg.d)]2.88±0.28(3) 6.94±1.43(3) 2.79±0.47(3) 635.09±108.88(3)

NO在腦缺血中的作用日益受到關(guān)注，它在腦缺血的不同時(shí)期發(fā)揮的作用不同，作用機(jī)制亦很復(fù)雜。NO的生物合成是通過(guò)3種不同的一氧化氮合成酶(NOS)催化生成的。3種同工酶包括內(nèi)皮型(endothelial NOS，eNOS)，主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞；神經(jīng)元型(neuronal NOS，nNOS)，主要分布在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)；誘導(dǎo)型(inducible NOS，iNOS)，主要分布在巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)。其中eNOS和nNOS為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)，主要參與生理功能的調(diào)節(jié)[9]。目前觀點(diǎn)傾向于在局灶性腦缺血中eNOS合成的NO具有神經(jīng)保護(hù)作用，iNOS合成的NO具有神經(jīng)毒性作用，主要參與遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，nNOS合成的NO的作用存在爭(zhēng)論，但主要認(rèn)為其參與了早期的缺血性神經(jīng)元損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦缺血再灌注小鼠腦缺血6h后，NO含量增加，而n-BuE可有效降低NO含量，故推測(cè)此作用亦是其對(duì)腦缺血再灌注小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

總之，n-BuE在腦缺血再灌注小鼠可發(fā)揮抗氧化作用并調(diào)節(jié)NO含量，從而發(fā)揮出一定的神經(jīng)保護(hù)作用。除此之外，亦有可能有其他機(jī)制參與，尚需進(jìn)一步的研究來(lái)闡明n-BuE的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為尋找新的治療腦缺血的藥物提供理論依據(jù)。

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