王天昊，樊雙義，閆潔，陳遠(yuǎn)，馬朋林

多年來(lái)，受限于對(duì)覺(jué)醒系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，昏迷治療的研究未取得重大突破。覺(jué)醒肽(orexins)的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)睡眠/覺(jué)醒的認(rèn)識(shí)進(jìn)入了新階段，也為昏迷的治療提供了廣闊前景。研究發(fā)現(xiàn)，雖然分泌orexins的神經(jīng)元僅位于下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)，但其神經(jīng)纖維卻可投射到網(wǎng)狀上行激動(dòng)系統(tǒng)包括藍(lán)斑在內(nèi)的廣泛區(qū)域，更重要的是該核內(nèi)神經(jīng)元屬去甲腎上腺素能(NA)神經(jīng)元[1-2]。因此，Ohno等[3]推 測(cè)orexins可能作用于腎上腺能神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)促進(jìn)去甲腎上腺素的釋放來(lái)發(fā)揮對(duì)睡眠/覺(jué)醒的調(diào)節(jié)作用。

酒精性昏迷是臨床上常見(jiàn)的昏迷類型，因易導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸循環(huán)抑制而受到廣泛關(guān)注。賈曉軍等[4]的研究證實(shí)，腦室注射orexin-A可縮短酒精性昏迷大鼠的昏迷時(shí)間，且存在劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，提示orexin-A對(duì)酒精性昏迷起促醒作用。然而，orexin-A促醒機(jī)制是否與腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)的激活相關(guān)尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向酒精性昏迷大鼠模型腦室內(nèi)注入特異性去甲腎上腺素受體阻斷劑，以翻正反射(LORR)持續(xù)時(shí)間和大鼠皮層腦電δ波作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討orexin-A對(duì)酒精性昏迷的促醒作用與去甲腎上腺素系統(tǒng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雌性SPF級(jí)SD大鼠24只(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重200±30g。按隨機(jī)數(shù)字排序分組法，將大鼠分為對(duì)照組、覺(jué)醒肽(orexin-A)組、阻斷劑哌唑嗪(prazosin)組及prazosin+orexin-A組4組。

1.2 主要溶液配置 人工腦脊液(ar tif icial cerebrospinal fluid，ACSF)中各種離子成分及其濃度(mmol/L)分別為：NaCl 126.0，KCl 2.5，CaCl22.0，MgCl22.0，NaH2PO41.25，NaHCO326.0，葡萄糖10.0。采用ACSF溶解配制成4nmol/5μl、4nmol/10μl兩種濃度的orexin-A溶液，配置劑量參考文獻(xiàn)[5-6]。取無(wú)水乙醇以生理鹽水稀釋配制成32%乙醇溶液。采用新鮮ACSF配制成63μg/5μl、63μg/10μl兩種濃度的Prazosin溶液。

1.3 酒精昏迷大鼠模型的建立及意識(shí)狀態(tài)分級(jí)參照El Ya coubi等[7]的方法建立酒精昏迷大鼠模型。大鼠腹腔注射32%乙醇溶液(14ml/kg)。大鼠意識(shí)狀態(tài)分為6級(jí)，分別為：Ⅰ級(jí)，籠內(nèi)活動(dòng)如常；Ⅱ級(jí)，籠內(nèi)活動(dòng)減少；Ⅲ級(jí)，籠內(nèi)活動(dòng)減少并運(yùn)動(dòng)失調(diào)；Ⅳ級(jí)，背部位于籠底部時(shí)能滾動(dòng)(LORR存在)，但不能站立；Ⅴ級(jí)，LORR消失，但對(duì)疼痛刺激有肢體回縮反應(yīng)；Ⅵ級(jí)，對(duì)任何刺激無(wú)反應(yīng)。其中Ⅴ、Ⅵ級(jí)被認(rèn)為是昏迷狀態(tài)[8]。本實(shí)驗(yàn)以LORR作為昏迷的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 腦電皮層電極及側(cè)腦室套管安放 以4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(30mg/kg)，將大鼠頭部固定，安裝電極。額葉電極：前囟前2mm，中線左旁開(kāi)2mm；頂葉雙電極：前囟后6mm，中線旁開(kāi)左、右4mm，深度以觸及硬腦膜為度(0.7～1.0mm)。參照Paxinos-Watson圖譜埋置自制側(cè)腦室金屬套管。部位：前囟后1.5mm，中線旁1.5mm，深度3.0mm，套管直徑0.8mm。電極安放后，動(dòng)物飼養(yǎng)2周。進(jìn)行皮層腦電圖(ECoG)記錄時(shí)，將記錄導(dǎo)線與腦皮層電極相連，接入RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)。記錄腦電圖，以δ波所占腦電波比例多少作為昏迷深度的判斷指標(biāo)。隨著昏迷深度增加，δ波所占腦電波的百分比增加。將給藥前δ波所占的百分比標(biāo)準(zhǔn)化為1，根據(jù)δ波百分比變化判斷給藥是否加深或減輕昏迷。

1.5 給藥方式 大鼠LORR消失后，各組均通過(guò)側(cè)腦室埋置的金屬套管微注射實(shí)驗(yàn)藥物。對(duì)照組腦室注入10μl ACSF；orexin-A組腦室注入10μl orexin-A(4nmol/10μl)；prazosin組腦室注入去甲腎上腺素α1受體阻斷劑prazosin(63μg/5μl)；prazosin+orexin-A組腦室注入prazosin(63μg/5μl)后再注入orexin-A 5μl(4nmol/5μl)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 側(cè)腦室不同給藥對(duì)酒精性昏迷大鼠LORR持續(xù)時(shí)間的影響 與對(duì)照組比較，給予orexin-A后LORR持續(xù)時(shí)間明顯縮短(2.9±0.3 vs 1.85±0.35，P＜0.01)；給予prazosin后，LORR持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(2.9±0.3 vs 4.55±0.55，P＜0.01)；在預(yù)先給予prazosin處理后再給予orexin-A，與對(duì)照組比較LORR持續(xù)時(shí)間無(wú)明顯縮短(2.9±0.3 vs 3.05±0.45，P＞0.05)，與orexin-A組比較LORR持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.01，圖1)。

圖1 側(cè)腦室不同給藥對(duì)酒精昏迷大鼠LORR持續(xù)時(shí)間的影響Fig.1 Effects of different administration into lateral cerebral ventricle on the duration of LORR of alcohol coma rats

2.2 側(cè)腦室給藥后不同時(shí)間對(duì)酒精性昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響 隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組δ波相對(duì)百分比逐漸下降。與對(duì)照組比較，給予orexin-A后大鼠δ波相對(duì)百分比下降速率顯著加快(P＜0.01)； 給予prazosin的大鼠，5min后δ波相對(duì)百分比明顯升高(96.46±6.55 vs 122.82±9.18，P＜0.01)；先給予prazosin預(yù)處理，再給予orexin-A，δ波相對(duì)百分比與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但與orexin-A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

3 討 論

圖2 側(cè)腦室給藥后不同時(shí)間對(duì)酒精昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響Fig.2 Effect of different time after administration into lateral ventricle on the ratio of δ of ECoG of alcohol coma rats

昏迷是覺(jué)醒系統(tǒng)結(jié)構(gòu)受損或功能受抑所致[9]，昏迷的促醒治療是臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為覺(jué)醒系統(tǒng)即指腦干上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)，目前觀點(diǎn)認(rèn)為，存在于下丘腦的orexins在覺(jué)醒系統(tǒng)中起啟動(dòng)作用，直接調(diào)節(jié)和影響著上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的功能，被稱為機(jī)體的“覺(jué)醒啟動(dòng)區(qū)”[9-10]，是調(diào)節(jié)睡眠和覺(jué)醒的關(guān)鍵神經(jīng)元。賈曉軍等[4]前期研究發(fā)現(xiàn)orexins不僅可調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒，還可對(duì)昏迷起促醒作用，但其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

去甲腎上腺素是傳統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，NA神經(jīng)元主要存在于低位腦干，其中藍(lán)斑的NA相對(duì)集中，同時(shí)也是重要的覺(jué)醒區(qū)域。藍(lán)斑神經(jīng)元放電及去甲腎上腺素的釋放在覺(jué)醒時(shí)最大，慢波睡眠時(shí)降低，快眼動(dòng)相(rapid eye movement，REM)睡眠時(shí)最小。研究發(fā)現(xiàn)，具有遺傳性多巴胺到去甲腎上腺素轉(zhuǎn)化缺陷的小鼠，其NA受體的激活作用減弱，會(huì)導(dǎo)致睡眠時(shí)間延長(zhǎng)并且在應(yīng)激狀態(tài)下不易喚醒[11]。orexins神經(jīng)元(大鼠約3000個(gè)，人約50 000個(gè))僅分布于下丘腦外側(cè)區(qū)，但orexins神經(jīng)元纖維卻可投射到上行激動(dòng)系統(tǒng)的廣泛區(qū)域。在orexins發(fā)現(xiàn)之前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腦內(nèi)的許多神經(jīng)遞質(zhì)與睡眠或覺(jué)醒相關(guān)，如單胺能(去甲腎上腺素、組胺、5-羥色胺)等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，腺苷、P物質(zhì)、GABA等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)等[12]，但它們?nèi)绾蜗嗷プ饔靡源龠M(jìn)覺(jué)醒或睡眠尚未闡明。orexins的發(fā)現(xiàn)使人們重新認(rèn)識(shí)了這些遞質(zhì)及其與orexins的關(guān)系。

近期研究發(fā)現(xiàn)，orexins的覺(jué)醒機(jī)制與傳統(tǒng)的興奮性單胺能神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)[3]。Bourgin等[13]發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)斑中局部應(yīng)用orexin-A，可劑量依賴性抑制REM睡眠、增加覺(jué)醒，并可使藍(lán)斑的NA神經(jīng)元放電頻率增加。同時(shí)，orexins受體OX1R大量表達(dá)于富含NA神經(jīng)元的藍(lán)斑。Kushikata等[14]對(duì)orexin A減少大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，皮層下去甲腎上腺素系統(tǒng)主要參與了orexin A的促覺(jué)醒功能。上述研究均證明orexin對(duì)覺(jué)醒的促醒作用機(jī)制與NA系統(tǒng)有關(guān)。

本研究通過(guò)運(yùn)用兩種經(jīng)典的監(jiān)測(cè)手段——LORR持續(xù)時(shí)間和皮層腦電圖來(lái)評(píng)判實(shí)驗(yàn)大鼠的意識(shí)狀態(tài)[15]，以探討orexins對(duì)酒精性昏迷這一臨床常見(jiàn)昏迷的促醒機(jī)制是否也與興奮單胺能神經(jīng)系統(tǒng)(如去甲腎上腺素)相關(guān)。其中，皮層腦電圖可直接在大腦皮層區(qū)域連續(xù)監(jiān)測(cè)皮層腦電活動(dòng)狀況，其振幅比頭皮腦電圖大10倍，靈敏度高?；杳詴r(shí)皮層腦區(qū)電活動(dòng)頻率明顯減慢、δ波所占比例增加。采用向側(cè)腦室內(nèi)給予去甲腎上腺素α1受體阻斷劑prazosin阻斷NA系統(tǒng)的激活，觀察其對(duì)orexin-A逆轉(zhuǎn)酒精性昏迷作用的影響，結(jié)果顯示，與給予orexin-A的促醒作用相反，給予prazosin的大鼠與對(duì)照組相比，5min后δ波相對(duì)百分比明顯升高，并持續(xù)30min以上，LORR持續(xù)時(shí)間亦顯著延長(zhǎng)，提示阻斷去甲腎上 腺素遞質(zhì)的作用可顯著加深昏迷的程度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，先給予prazosin預(yù)處理再給予orexin-A，與對(duì)照組相比，δ波比例并沒(méi)有因orexin-A而降低，LORR持續(xù)時(shí)間亦并未因orexin-A的興奮性作用而縮短，即orexin-A的興奮作用被prazosin阻斷。此結(jié)果提示NA系統(tǒng)的激活是orexin-A對(duì)酒精性昏迷大鼠促醒的重要機(jī)制之一。

綜上所述，orexin-A對(duì)酒精性昏迷大鼠有良好的促醒作用。但是目前暫無(wú)臨床可用的orexin-A，且價(jià)格昂貴，本研究證實(shí)其促醒作用機(jī)制為臨床尋找新的促醒藥物提供了線索。

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