黃 蓉，徐明生 ，吳磊燕，杜華英

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045)

蛋清卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin，OVT)約占蛋清蛋白質(zhì)總量的12%，是一種易溶的非結(jié)晶蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為78 KDa。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具有廣譜的抗菌功能，對(duì)大腸桿菌［1－2］、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、異變鏈球菌等均具有抗菌活性［3］。Mendonca 等［4］研究顯示，添加了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的火腿對(duì)李斯特氏菌有抑制作用，說(shuō)明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以作為抗菌劑加到肉制品中?？梢?jiàn)將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白開(kāi)發(fā)為天然的防腐劑和抗菌劑應(yīng)用于各類食品，或制成天然抗菌藥物等，其應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景十分廣闊。

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抑菌作用主要在于它可以?shī)Z取微生物生長(zhǎng)所必須的鐵［5］，而卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)鐵的結(jié)合和釋放與它的結(jié)構(gòu)有很重要的關(guān)系［6］，故可以通過(guò)化學(xué)修飾改變卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)，提高其結(jié)合鐵的能力，從而提高卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抑菌作用。在各種修飾方法中，磷酸化已被證明是一種有效提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的修飾方法，國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果表明磷酸化后的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上都有很大的變化［7－9］。Yoko Hayashi 等［10］用焦磷酸鹽干熱磷酸化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，提高了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的電泳遷移率、熱穩(wěn)定性、乳化性等。本研究利用三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，STP)對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行修飾改性，以提高卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抑菌活性，以期為食品行業(yè)提供一種更好的抑菌劑。且三聚磷酸鈉是我國(guó)GB 2760 －1996和FDA 允許使用的食品添加劑，早已用于食品工業(yè)中，因而利用STP 對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行改性，是安全可行的［11－12］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(實(shí)驗(yàn)室制備，純度80%);菌種(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院菌種保藏中心;固體培養(yǎng)基(瓊脂肉湯培養(yǎng)基);液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基);磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)液(1 mg/mL);三聚磷酸鈉;鉬酸銨;無(wú)水亞硫酸鈉;1，4 －對(duì)苯二酚;分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS－3E 型pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;Scientz －系列N 型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;V－5600 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;D －1 型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)易有限公司;Spx－250 －Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的磷酸化 配制1%的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液，邊攪拌邊加入一定量STP，調(diào)pH，在30 ℃水浴中反應(yīng)一段時(shí)間(正交試驗(yàn)各因素水平見(jiàn)表1)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH 到中性后，將無(wú)機(jī)磷酸鹽透析完全(鉬藍(lán)比色法檢驗(yàn))，冷凍干燥，制得磷酸化的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(PP －OVT)進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 variables and levels of orthogonal experiment

1.3.2 PP－OVT 抑菌活性的測(cè)定 采用管碟法［13］無(wú)菌操作下，取液體培養(yǎng)的菌液0.1 mL 均勻涂布于平板培養(yǎng)基上，約干燥后，輕輕將牛津杯置于其上，分別在牛津杯中加入0.2 mL 20 mg/mL 的PP －OVT(0.45 μm 孔徑微孔濾膜除菌)，用無(wú)菌水及未磷酸化的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液做對(duì)照，然后小心將培養(yǎng)皿移入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 ～48 h 后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3 磷酸化程度的測(cè)定 采用鉬藍(lán)比色法［14］分別吸取磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 至50 mL 容量瓶中，依次加入5 mL 鉬酸銨溶液，搖勻，靜置幾秒，加入2.5 mL 亞硫酸鈉溶液及2.5 mL 對(duì)苯二酚溶液，加蒸餾水定容至50 mL，搖勻，靜置30 min，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)PP －OVT 溶于蒸餾水中，用上述方法測(cè)定試樣的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PP － OVT 的磷含量。以原蛋白作為空白，磷酸化程度以每100 g 蛋白質(zhì)所含磷的克數(shù)表示。

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of the phosphorus

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(版本6.5.5.8)進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1 可知回歸方程為:y =0.052 1x +0.006 8，其中R2為0.997 2。式中:y 一吸光度;x 一磷含量(mg)。

2.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白磷酸化正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析

2.2.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白磷酸化正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析 由表2 可以看出影響PP －OVT 抑菌活性的各因素主次依次是pH、STP 使用量、反應(yīng)時(shí)間。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析表Tab.2 Visual analysis of orthogonal experiment

2.2.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白磷酸化正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和多重比較分析 (1)PP －OVT 對(duì)大腸桿菌抑菌活性的方差分析和多重比較分析。從表3 方差分析的結(jié)果顯示pH 對(duì)磷酸化有顯著的影響，而STP 使用量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷酸化無(wú)顯著差異。表4 多重比較分析可以看出A2 與A1 有顯著差異。因而可選出最優(yōu)方案:pH 值為9，OVT/STP 為1 g/1 g，時(shí)間為1 h。

(2)PP－OVT 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的方差分析和多重比較分析。

表3 PP－OVT 對(duì)大腸桿菌抑菌活性的方差分析表Tab.3 Variance analysis of antibacterial effete on Escherichia coli by PP－OVT

表4 PP－OVT 對(duì)大腸桿菌抑菌活性的多重比較表(LSD 法)Tab.4 Multiple comparison of antibacterial effete on Escherichia coli by PP－OVT

從表5 和表6 可以看出:方差分析的結(jié)果顯示pH 對(duì)磷酸化有極顯著差異，STP 使用量對(duì)磷酸化有顯著的影響，多重比較分析的結(jié)果顯示A2 與A3 和A1 均有極顯著差異，B3 與B1 有顯著差異，因而可選出最優(yōu)方案:pH 值為9，OVT/STP 為1 g/10 g，時(shí)間為1 h。

(3)PP－OVT 對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性的方差分析和多重比較分析。

表5 PP－OVT 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的方差分析表Tab.5 Variance analysis of antibacterial effete on Staphylococcus aureus by PP－OVT

表6 PP－OVT 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的多重比較表(LSD 法)Tab.6 Multiple comparison of antibacterial effete on Staphylococcus aureus by PP－OVT

從表7 和表8 可以看出:方差分析的結(jié)果顯示pH、STP 使用量和反應(yīng)時(shí)間均對(duì)磷酸化均無(wú)差異，多重比較分析的結(jié)果顯示A2 與A1 有顯著差異，因而可選出最優(yōu)方案:pH 值為9，OVT/STP 為1 g/1 g，時(shí)間為1 h。

從以上結(jié)果看，如果單獨(dú)考慮PP－OVT 對(duì)大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌的抑制作用，可以選擇磷酸化修飾的工藝條件為pH 值為9，OVT/STP 為1 g/1 g，時(shí)間為1 h。但是我們期望將PP－OVT 作為一種廣譜抑菌劑應(yīng)用在各類食品中，所以綜合考慮PP－OVT 對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，其最優(yōu)的磷酸化修飾工藝條件應(yīng)為:pH 值為9，OVT/STP 為1 g/10 g，時(shí)間為1 h，并測(cè)得其磷酸化程度為4.7%。

表7 PP－OVT 對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性的方差分析表Tab.7 Variance analysis of antibacterial effete on Bacillus subtilis by PP－OVT

表8 PP－OVT 對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性的多重比較表(LSD 法)Tab.8 Multiple comparison of antibacterial effete on Bacillus subtilis by PP－OVT

2.3 最優(yōu)磷酸化改性工藝條件下制備的PP－OVT 抑菌性能分析

從表9 可以看出:經(jīng)過(guò)磷酸化修飾，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌活性有極顯著提高，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性有顯著提高。

表9 PP－OVT 與OVT 對(duì)3 種菌抑菌活性的比較Tab.9 comparison of antimicrobial activity between PP－OVT and OVT

圖2 PP－OVT 對(duì)3 種菌抑菌活性Fig.2 The antimicrobial activity of PP－OVT

3 討論

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