陳林林， 謝 青，單曉亮， 權會琴，陳慶美， 周 帆，聶 丹， 唐 霓

全世界大約有4億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，中國約占 1/3［1］。乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科，全長3.2 kb，含有4個部分雙鏈的開放讀碼框，分別編碼核心蛋白、表面抗原、X蛋白以及病毒DNA聚合酶，其中乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的生物學功能較活躍，已明確和腫瘤的發(fā)生相關。

分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)家族作為腫瘤抑制蛋白，是Wnt/βcatenin信號轉(zhuǎn)導通路的拮抗蛋白。分泌型卷曲相關蛋白5(secreted frizzled-related proteins 5，SFRP5)是SFRPs家族(SFRP1～5)成員之一，其表達下調(diào)可減弱對Wnt信號通路的抑制作用，促使通路活化，異常激活的Wnt信號轉(zhuǎn)導通路可參與人類多種腫瘤的發(fā)生［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，HBx可通過激活 Wnt/β-catenin信號通路，導致細胞異常增殖，從而參與原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinogenesis，HCC)的發(fā)生，但具體機制不明。本研究擬在細胞水平研究HBx能否影響SFRP5啟動子活性，并且深入分析HBx下調(diào)SFRP5基因啟動子的分子機制。

材料和方法

1 主要質(zhì)粒和細胞

人肝癌細胞系 Huh 7、人正常肝細胞系LO2、螢光素酶報告質(zhì)粒pGL3-Basic、對照質(zhì)粒載體pRL-TK和大腸桿菌DH10B均為本實驗室保存。

2 主要試劑

Lipofectamine 2000購自Invitrogen;限制性核酸內(nèi)切酶Nhe I和BglⅡ、T4 DNA連接酶、Wizard質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和基因組DNA提取試劑盒均為Promega產(chǎn)品;1%青/鏈霉素和MEM液體培養(yǎng)基購自HyClone;胎牛血清購自Gibco;其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。引物序列見表1，由Invitrogen合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 SFRP5截短體啟動子報告載體的構建及鑒定根據(jù)SFRP5啟動子序列設計5對截短體引物，擴增長度分別為525 bp、858 bp、1 282 bp和1 724 bp和2 119 bp。首先提取Huh 7細胞基因組DNA作為模板，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增SFRP5啟動子截短體。PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，最適退火溫度退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸10 min，退火溫度及循環(huán)數(shù)見表1。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色后，用凝膠成像儀記錄。膠回收PCR產(chǎn)物與pGL3-Basic載體同時用 Nhe I和BglⅡ雙酶切，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)菌。挑選陽性克隆，擴增后小量提取質(zhì)粒進行酶切鑒定并測序。

3.2 細胞轉(zhuǎn)染及病毒感染 按4×105cells/well將LO2細胞鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至50%融合時進行轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒2.25 μg，其中 pRL-TK質(zhì)粒用量均為 0.25 μg，質(zhì)粒分為 6 組，用量各 2 μg，分別命名為:pGL3-P1(－478 bp～+47 bp)，pGL3-P2(－811 bp～ +47 bp)，pGL3-P3(－1 235 bp～ +47 bp)，pGL3-P4(－1 677 bp～ +47 bp)，pGL3-P5(－2 072 bp～ +47 bp)，pGL3-Basic。次日將細胞重新鋪板，細胞貼壁后每組細胞按105個細胞鋪于24孔板中，分別感染最適滴度的感染編碼HBx的腺病毒(Ad-HBx)或編碼綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)。每組設3個復孔，病毒感染后36 h收集細胞進行螢光素酶活性檢測。

3.3 SFRP5啟動子活性檢測 按照Promega公司雙螢光素酶檢測試劑盒說明書進行操作，主要步驟為:PBS清洗細胞后加入 100 μL 1×passive lysis buffer，把裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，室溫14 000 r/min離心10 min，收集上清液。TK質(zhì)粒作為內(nèi)參對照標化轉(zhuǎn)染效率，每組的相對螢光素酶活性用螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性的比值來表示。

4 統(tǒng)計學處理

每次實驗設3個復孔，進行獨立的3次重復實驗。用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SFRP5啟動子截短突變體報告載體的構建

如圖1所示，PCR擴增的SFRP5啟動子截短體長度分別為 525 bp、858 bp、1 282 bp、1 724 bp 和2 119 bp。用Nhe I和BglⅡ限制性內(nèi)切酶對pGL3-P1～P5重組質(zhì)粒分別進行雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約 525 bp、858 bp、1 282 bp、1 724 bp和2 119 bp的條帶，符合預期結果，見圖2。DNA測序結果與PubMed所提供的人類SFRP5基因啟動子序列完全一致，證明質(zhì)粒構建成功。

Figure 1.PCR products of SFRP5 promoter.1:PCR product of 525 bp(－478 bp～ +47 bp);2:PCR product of 858 bp(－811 bp～ +47 bp);3:PCR product of 1 724 bp(－1 677 bp～ +47 bp);4:PCR product of 2 119 bp(－2 072 bp～ +47 bp);5:PCR product of 1 282 bp(－1 235 bp～ +47 bp);M:DNA marker 2000圖1 SFRP5啟動子截短體的PCR擴增

2 重組腺病毒病毒感染

采用Ad-HBx或Ad-GFP腺病毒來觀察和評估感染效率。感染后24 h倒置熒光顯微鏡可觀察到部分綠色熒光，HBx感染組和GFP對照組感染率沒有明顯差異，見圖3。

Figure 2.Identification of SFRP5 promoter recombinant plasmids by restriction enzyme digestion.1，3，5，7，9:pGL3-P1～pGL3-P5;2，4，6，8，10:pGL3-P1 ～ pGL3-P5 digested by Nhe I and BglⅡ;M:DNA marker 2000.圖2 SFRP5啟動子區(qū)截短報告質(zhì)粒的酶切鑒定

3 HBx下調(diào)SFRP5啟動子活性

將pGL3-P1～5或陰性對照質(zhì)粒pGL3-Basic與pRL-TK共轉(zhuǎn)染LO2細胞，轉(zhuǎn)染后24 h分別感染Ad-GFP或Ad-HBx，同時以pGL3-Basic和pRL-TK共轉(zhuǎn)染組為對照組。pGL3-P1～5和pRL-TK共轉(zhuǎn)染LO2細胞，相對螢光素酶活性與對照組相比明顯升高，螢光素酶活性分別為(6.32±0.04)倍(－478 bp～+47 bp)、(5.79 ±0.32)倍 (－811 bp～ +47 bp)、(3.59±0.34)倍(－1 235 bp～ +47 bp)、(3.86±0.39)倍(－1 677 bp～ +47 bp)和(3.26±0.42)倍(－2 072 bp～+47 bp)(均P＜0.05)。過表達HBx后螢光素酶活性分別為(3.55±0.37)倍(－478 bp～+47 bp)(P＜0.05)、(3.15±0.25)倍 (－811 bp～+47 bp)(P＜0.05)、(2.59±0.34)倍(－1 235 bp～ +47 bp)、(2.96± 0.50)倍(－1 677 bp～ +47 bp)和(1.97±0.15)倍(－2 072 bp～ +47 bp)。分析后可觀察到HBx明顯抑制SFRP5啟動子活性，抑制率分別為44%(－478 bp～+47 bp)(P＜0.05)、46%(－811 bp～ +47 bp)(P＜0.05)、28%(－1 235 bp～ +47 bp)、24%(－1 677 bp～ +47 bp)和40%(－2 072 bp～ +47 bp)，見圖4和表2。

Figure 3.Fluorescence images of LO2 cells 24 h after Ad-GFP(A)and Ad-HBx(B)infection(×200).圖3 熒光顯微鏡觀察腺病毒感染效率

Figure 4.Analysis of lusiferase activity of LO2 cells which were transfected with constructed plasmids and infected by Ad-GFP and Ad-HBx.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs pGL3-Basic;#P ＜0.05 vs GFP.圖4 SFRP5啟動子截短體螢光素酶檢測

表2 螢光素酶活性分析Table 2.Analysis of luciferase activity(mean±SD.n=3)

討 論

已有報道HBV感染相關的肝癌組織中發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路的異?；罨?-7］。Wnt/βcatenin信號通路異常活化的原因可能包括如β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、結腸腺瘤性息肉病相關因子(adenomatous polyposis coli，APC)等的突變和一些拮抗因子的異常失活。Wnt/β-catenin信號通路拮抗因子主要包括Dickkopf因子和SFRPs家族。SFRPs家族含有5個分泌型的糖蛋白家族成員(SFRP1～5)，SFRPs基因定位于染色體8p12～11.1，其蛋白約有300個氨基酸殘基，包括一個同源的N2末端和一個C2末端。SFRPs的分子結構與Wnt受體極為相似，均具有相同的半胱氨酸富集結構域，它們可通過競爭性結合fozivudine tidoxil(Fzd)受體而抑制Wnt信號通路的活化。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染不同區(qū)段的SFRP5啟動子截短體后，－478 bp～+47 bp區(qū)域啟動子活性最高，與對照相比，提高了6.32倍，用Ad-HBx感染后啟動子活性明顯下降。這提示這個區(qū)域可能存在調(diào)控SFRP5啟動子轉(zhuǎn)錄活性的關鍵元件，采用生物信息學分析結果顯示此區(qū)域包括激活蛋白2(activator protein 2，AP-2)、GC 盒(GC box/C/EBP)等重要調(diào)節(jié)元件，對于SFRP5啟動子的調(diào)控功能非常重要。但是HBx具體通過哪種機制下調(diào)SFRP5啟動子活性，調(diào)節(jié)機制尚不明確。

DNA甲基化和組蛋白去乙?；梢允筍FRPs啟動子活性下降，可能導致肝癌的發(fā)生。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀修飾途徑之一，能抑制功能基因的表達［8］。研究發(fā)現(xiàn)除了甲基化修飾的DNA可直接作用于甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子，失去與DNA結合的能力從而阻斷轉(zhuǎn)錄，此外甲基化黏附分子可通過作用于甲基化非敏感轉(zhuǎn)錄因子，從而阻斷轉(zhuǎn)錄［9-12］。除了基因啟動子區(qū)直接甲基化修飾調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄外，組蛋白修飾在基因表達調(diào)控中也起到至關重要的作用。在組蛋白H3上，共有5個賴氨酸位點可以被甲基化修飾，一般來說，組蛋白H3的4號賴氨酸(histone 3 lysine 4，H3K4)的甲基化主要聚集在活躍轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)域。組蛋白H3的9號賴氨酸(histone 3 lysine 9，H3K9)的甲基化同基因的轉(zhuǎn)錄抑制及異染色質(zhì)有關。EZH2(enhancer of zeste homolog 2)可以甲基化組蛋白H3的27號賴氨酸(histone 3 lysine 27，H3K27)，導致相關基因的沉默，并且與X染色體失活相關。組蛋白H3的36號賴氨酸(histone 3 lysine 36，H3K36)的甲基化與基因轉(zhuǎn)錄激活相關［13-14］。

綜上所述，本研究成功構建了SFRP5啟動子區(qū)5個截短突變報告質(zhì)粒，通過對各個截短體轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控尋找核心啟動子區(qū)域，為尋找影響啟動子活性的關鍵轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù);并且檢測了各區(qū)段啟動子轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)HBx可以明顯下調(diào)SFRP5啟動子區(qū)活性，提示HBx引起的SFRP5啟動子區(qū)活性下降，可能參與Wnt信號的異?；罨⑴cHBV感染相關肝癌的發(fā)生密切相關。

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