吳 帆， 張 普， 俞佳文， 盧婷婷， 李校堃， 林灼鋒△

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是由自身免疫引起多個(gè)系統(tǒng)和臟器受累的自身免疫性疾病，由于體內(nèi)的細(xì)胞和體液免疫功能障礙，導(dǎo)致產(chǎn)生了多種的自身抗體，然而其具體的發(fā)病機(jī)制還不明確［1］。載脂蛋白 A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)的一種主要成分，在HDL的抗炎效應(yīng)中起到了重要的作用，在動(dòng)物模型中介導(dǎo)了緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的保護(hù)作用［2-3］。從 apoA-I類似肽4F，根據(jù)apoA-I的生物特性，設(shè)計(jì)出的具有雙親性的apoA-I模擬肽L-4F，由18個(gè)L-氨基酸組成，具有通過哺乳動(dòng)物胃腸道抑制酶降解的優(yōu)點(diǎn)，并能增強(qiáng)HDL的抗炎能力［4］。早期的研究發(fā)現(xiàn)，口服L-4F能促使HDL從促炎因子轉(zhuǎn)化為抗炎因子，促進(jìn)膽固醇流出，并使其從巨噬細(xì)胞中逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)減少apoE－/－小鼠中主動(dòng)脈的損傷但不影響其血清膽固醇的水平［5］。ApoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠在正常飲食情況下會(huì)自發(fā)地形成IgG自身抗體、腎小球腎炎、骨質(zhì)疏松和粥樣硬化等系統(tǒng)性紅斑狼瘡病變［6-7］。我們?cè)缙诘难芯堪l(fā)現(xiàn)，L-4F 能緩解 apoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠的狼瘡病變狀況［8］。本文將繼續(xù)探討L-4F對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎臟病變的影響，從而進(jìn)一步揭示L-4F對(duì)紅斑狼瘡性腎臟病變的治療意義。

材料和方法

1 動(dòng)物

ApoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠為 apoE－/－和Fas－/－單基因敲除小鼠相互雜交繁殖后篩選的雙基因缺陷小鼠，上述單基因敲除小鼠均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，并在溫州醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)環(huán)境下繁殖飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 動(dòng)物處理 8～9周齡時(shí)，雌性 apoE－/－Fas－/－小鼠隨機(jī)地分為2組:L-4F治療組(15 mg/kg，0.1 g/L Tween-20溶解在pH 7.0的50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液中，腹腔注射給藥，n=10)和空白對(duì)照組(生理鹽水腹腔注射，n=10)。在L-4F處理過程中，分別在0、5、10、15、20、25 周收集血樣標(biāo)本，觀察抗雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)IgG和總IgG的變化狀況。L-4F處理25周后，小鼠饑餓過夜，通過心臟穿刺的方法收集血樣后處死，然后采用冰冷PBS灌注心臟，收集脾臟，淋巴結(jié)和腎臟等相關(guān)器官組織，按下列方法進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 自身抗體和細(xì)胞因子測(cè)定分析 將上述收集的血清樣品，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)總IgG抗體、白細(xì)胞介素 6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、抗 dsDNA、抗氧化磷脂(POVPC和PGPC)等血清抗體水平 (Bethyl Laboratories);采用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清總脂聯(lián)素滴度;同時(shí)采用生化檢測(cè)法檢測(cè)血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的含量。

2.3 腎臟組織學(xué)分析 小鼠處死后，取出其中一個(gè)腎臟用10%甲醛固定，石蠟包埋組織，切片至5 μm，使用HE染色法對(duì)腎臟進(jìn)行染色。通過計(jì)算機(jī)輔助圖像軟件(Image-Pro Plus)對(duì)腎小球大小面積進(jìn)行分析。即在相同具有代表性的區(qū)域內(nèi)觀察每個(gè)樣品中25到30個(gè)單位的腎小球，并以此計(jì)算每只小鼠的平均腎小球叢。

2.4 蛋白尿測(cè)定 在給予L-4F治療25周時(shí)，收集每只小鼠的晨尿，并采用蛋白尿檢查試紙(Bayer)測(cè)定新鮮尿液的蛋白水平。蛋白尿表示為下列的水平:0=無，1=微量，2= ～30 mg/dL，3= ～100 mg/dL，4= ～300 mg/dL，5≥2 000 mg/dL。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism 3.0(GraphPad)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組之間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 L-4F對(duì)狼瘡樣自身免疫病變表型特征的影響

給藥27周后，與對(duì)照組小鼠相比，L-4F的治療能使 apoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠的淋巴結(jié)顯著減小(圖1A)，脾臟重量顯著降低(圖1B)。這些結(jié)果說明，L-4F對(duì)自身免疫性疾病狼瘡樣病變表型具有抑制作用。

Figure 1.The changes of weight of lymph nodes(A)and spleen(B)in apoE－/－ Fas－/－ C57BL/6 mice after L-4F treatment.Mean ± SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.圖1 L-4F處理后淋巴結(jié)及脾臟大小的變化

2 L-4F對(duì)抗dsDNA及抗氧化磷脂抗體及炎癥因子水平的影響

dsDNA抗體的出現(xiàn)是lupus發(fā)病過程中最為重要的臨床檢測(cè)標(biāo)志物之一。我們的結(jié)果顯示，L-4F治療27周后，與對(duì)照組相比較，給藥組的血清抗ds-DNA IgG抗體明顯低于對(duì)照組(圖2A)，但其總IgG水平?jīng)]有顯著差異(圖2B)。

L-4F治療后，與空白對(duì)照組相比，血清抗氧化磷脂PGPC和POVPC的IgG自身抗體水平顯著下降，見圖3A、B。此外，炎癥因子IL-6和TNF-α循環(huán)水平均顯著下調(diào)(P ＜0.05)，見圖3C、D。

Figure 2.The changes of anti-dsDNA IgG(A)and total IgG(B)levels in apoE－/－Fas－/－C57BL/6 mice after L-4F treatment.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05 vs control.圖2 L-4F處理后抗dsDNA IgG和總IgG水平的變化

Figure 3.The changes of serum oxidative phospholipid antibodies(A，B)and inflammatory factors(C，D)in apoE－/－Fas－/－C57BL/6 mice after L-4F treatment.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 L-4F治療后血清氧化磷脂抗體及炎癥因子水平的變化

3 L-4F對(duì)狼瘡腎病變狀況的影響

腎臟疾病通常隨著尿蛋白水平的增加而加重，在給藥后的25周時(shí)間里，L-4F組與對(duì)照組相比尿蛋白水平更低，且BUN水平均有所下降，見圖4A、B。組織學(xué)研究顯示，L-4F治療組小鼠平均腎小球面積顯著低于空白對(duì)照組，見圖4C。

4 L-4F對(duì)血清脂聯(lián)素水平表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，L-4F能顯著上調(diào)血清脂聯(lián)素水平(P ＜0.05)，見圖5。

討 論

SLE是自身免疫介導(dǎo)的、以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，血清中出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體和多系統(tǒng)累及是SLE的兩個(gè)主要臨床特征［9］。早在1976年，人們已經(jīng)注意到了系統(tǒng)性紅斑狼瘡死亡率曲線呈“雙峰”模式，一個(gè)是在活動(dòng)性狼瘡早期階段敗血癥的高發(fā)生率，另一個(gè)是非活動(dòng)性狼瘡?fù)砥陔A段心肌梗死的高發(fā)生率［10］。

Figure 4.The effect of L-4F treatment on lupus nephritis.A:urine protein level;B:blood urea nitrogen(BUN)level;C:glomerular tuft size(HE staining，×400).Mean± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control圖4 L-4F對(duì)狼瘡腎病變狀況的影響

Figure 5.L-4F stimulated adiponectin expression in apoE－/－Fas－/－ C57BL/6 mice.Mean ± SD.n=10.＊＊ P ＜0.01 vs control.圖5 L-4F 上調(diào) apoE－/－Fas－/－小鼠脂聯(lián)素的表達(dá)

ApoA-I是HDL的一種主要成分，其主要功能是通過ABCA1途徑轉(zhuǎn)運(yùn)清除磷脂和膽固醇，L-4F是一種apoA-I模擬肽，在apoE-null小鼠的飲用水中加入L-4F能夠顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化病變，動(dòng)脈粥樣硬化的損傷減少達(dá)到75%以上，但對(duì)血漿脂類水平?jīng)]有顯著的影響［11］，除了參與調(diào)控膽固醇之外，apoA-I模擬肽還具有良好的抗炎效應(yīng)，可抑制大鼠中的炎癥反應(yīng)，提高存活率［12］。

我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，在 apoE－/－Fas－/－C57BL/6雙基因敲除自發(fā)性引起的鼠類狼瘡模型中，L-4F治療后將有效地減輕狼瘡樣自身抗體產(chǎn)物、腎小球腎炎、骨質(zhì)減少的表型［8］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，L-4F除了能降低腎小球叢大小、抗PGPC和POVPC抗體水平之外，還能顯著降低血清促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平。這些結(jié)果充分說明，L-4F能顯著緩解apoE－/－Fas－/－C57BL/6小鼠的狼瘡病變狀況。

腎臟受累和腎小球腎炎是SLE患者中常見且較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，同時(shí)腎臟損傷的嚴(yán)重性與疾病表型的程度有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中 apoE－/－Fas－/－C57BL/6小鼠給藥25周后，與對(duì)照組小鼠相比較，L-4F治療組小鼠的尿蛋白和血清尿素氮水平顯著降低;此外，在組織形態(tài)學(xué)方面，L-4F治療組小鼠平均腎小球面積顯著低于空白對(duì)照組小鼠。這些結(jié)果表明，L-4F治療后，腎小球的病變得到一定程度的緩解。

脂聯(lián)素是一種來源于脂肪細(xì)胞分泌表達(dá)的荷爾蒙因子。早期的研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素對(duì)包括糖尿病、心血管、肥胖等多種代謝引發(fā)的疾病發(fā)病具有顯著的抑制作用［13-15］。此外，我們的前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腎病發(fā)病過程中，脂聯(lián)素水平隨腎功能的丟失而顯著上升［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，L-4F治療能顯著降低apoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠尿蛋白和 BUN 的水平，并減少腎小球的面積。這些結(jié)果說明L-4F能改善狼瘡腎臟病變的惡化狀況;與此同時(shí)，L-4F治療顯著上調(diào)血清脂聯(lián)素的水平。因此，我們推斷，腎病發(fā)病過程中脂聯(lián)素水平的上升是機(jī)體自身的一種保護(hù)作用;L-4F上調(diào)脂聯(lián)素水平是一種積極的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，L-4F能顯著改善狼瘡樣小鼠的腎臟病變狀況，對(duì)治療狼瘡腎病變具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值和意義，但其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 梁柳琴，陳偉玲，邱 茜，等.ROCK對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)控［J］.中國病理生理雜志，2012，28(12):2270-2273.

［2］ Plump AS，Scott CJ，Breslow JL.Human apolipoprotein A-I gene expression increases high density lipoprotein and suppresses atherosclerosis in the apolipoprotein E-deficient mouse［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(20):9607-9611.

［3］ Navab M，Berliner JA，Subbanagounder G，et al.HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21(4):481-488.

［4］ Navab M，Anantharamaiah GM，Reddy ST，et al.Apolipoprotein A-I mimetic peptides［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(7):1325-1331.

［5］ Navab M，Ruchala P，Waring AJ，et al.A novel method for oral delivery of apolipoprotein mimetic peptides synthesized from all L-amino acids［J］.J Lipid Res，2009，50(8):1538-1547.

［6］ Feng X，Li H，Rumbin AA，et al.ApoE－/－Fas－/－C57BL/6 mice:a novel murine model simultaneously exhibits lupus nephritis， atherosclerosis， and osteopenia［J］.J Lipid Res，2007，48(4):794-805.

［7］ Pineau CA，Urowitz MB，F(xiàn)ortin PJ，et al.Osteoporosis in systemic lupus erythematosus:factors associated with referral for bone mineral density studies，prevalence of osteoporosis and factors associated with reduced bone density［J］.Lupus，2004，13(6):436-441.

［8］ Woo JM，Lin Z，Navab M，et al.Treatment with apolipoprotein A-1 mimetic peptide reduces lupus-like manifestations in a murine lupus model of accelerated atherosclerosis［J］.Arthritis Res Ther，2010，12(3):R93.

［9］ Stanic AK，Stein CM，Morgan AC，et al.Immune dysregulation accelerates atherosclerosis and modulates plaque composition in systemic lupus erythematosus［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(18):7018-7023.

［10］ Urowitz MB，Bookman AA，Koehler BE，et al.The bimodal mortality pattern of systemic lupus erythematosus［J］.Am J Med，1976，60(2):221-225.

［11］Navab M，Anantharamaiah GM，Hama S，et al.Oral administration of an apoA-I mimetic peptide synthesized from D-amino acids dramatically reduces atherosclerosis in mice independent of plasma cholesterol［J］.Circulation，2002，105(3):290-292.

［12］ Zhang Z，Datta G，Zhang Y，et al.Apolipoprotein A-I mimetic peptide treatment inhibits inflammatory responses and improves survival in septic rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(2):H866-H873.

［13］ Wong WT，Tian XY，Xu A，et al.Adiponectin is required for PPARγ-mediated improvement of endothelial function in diabetic mice［J］.Cell Metab，2011，14(1):104-115.

［14］ Hui X，Lam KS，Vanhoutte PM，et al.Adiponectin and cardiovascular health:an update［J］.Br J Pharmacol，2012，165(3):574-590.

［15］ Xu A，Wang Y，Lam KS，et al.Vascular actions of adipokines molecular mechanisms and therapeutic implications［J］.Adv Pharmacol，2010，60:229-255.

［16］ Lin Z，Zhou Z，Liu Y，et al.Circulating FGF21 levels are progressively increased from the early to end stages of chronic kidney diseases and are associated with renal function in Chinese［J］.PLoS One，2011，6(4):e18398.