章亞妮，鄔珊維，徐佳瑤，陳 偉，呂媛媛

(浙江大學城市學院醫(yī)學院，浙江 杭州 310015)

靜電紡絲是一種借助于靜電場作用對聚合物溶液或熔體進行紡絲的過程，它所形成的纖維直徑為亞微米級。靜電紡絲制成的超細纖維膜，具有多孔結構，有較高的比表面積，在過濾、納米復合材料、傷口敷料以及組織工程支架等方面具有許多潛在的用途。靜電紡絲法制備的修復用無紡納米纖維膜的孔徑通常為50 nm～1μm，可以用來阻擋細菌和灰塵所致的創(chuàng)傷感染，因此在傷口敷料領域具有廣泛的用途［1-3］。丹參素(Salvianic acid A，SA)是從中國傳統(tǒng)中藥唇形科植物丹參中提取到的一個具有酚性芳香酸類化合物，具有廣泛的藥理作用。近年來愈來愈多的研究表明，丹參素能促進創(chuàng)傷組織修復:丹參素對轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板活化因子(PAF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等多種細胞因子的分泌具有調節(jié)作用，且能顯著抑制內(nèi)毒素誘導的上述因子的大量分泌，具有抗炎和增強免疫這兩方面的調節(jié)作用;此外，能促進實驗性創(chuàng)傷動物感染創(chuàng)面修復，并可顯著抑制TNF-α、IFN-γ 等炎癥介質的產(chǎn)生［4-6］。通過改變給藥途徑，將丹參素作為主藥載入高分子載體材料中，結合高新材料加工方法制備成現(xiàn)代新型醫(yī)用敷料，不僅賦予丹參素外用于皮膚的新用途，也為中藥劑型開發(fā)開辟了新途徑。

殼聚糖(Chitosan，CS)具有止痛、止血、減小疤痕、良好的生理相容性和生物可降解性等優(yōu)異性能非常適宜于作為傷口敷料的原料［7-10］。但由于它所形成的膜較脆，力學性能不好，因而常采用與其他生物可降解高分子材料相結合，經(jīng)高新技術方法加工制成復合型敷料。因此，本研究采用生物相容性良好的天然高分子材料殼聚糖(Chitosan，CS)和成纖性好、生物相容性優(yōu)、可生物降解的合成高分子聚合物聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)混合為載體材料，擔載丹參素鈉(Salvianic acid A sodium，SAS;丹參素在自然界中不穩(wěn)定，故把其做成鈉鹽，功效和丹參素一樣)，通過靜電紡絲制備成載藥醫(yī)用纖維，對纖維的形態(tài)、藥物與纖維載體的結合狀態(tài)、纖維含藥量以及載藥纖維的釋藥特性進行了研究，為以后的臨床應用提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50，國藥集團化學試劑有限公司)，殼聚糖(CS，醫(yī)用級，脫乙?；葹?2.5%，國藥集團化學試劑有限公司)，乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，丹參素鈉(SAS，純度99%，西安鴻生生物技術有限公司)，紫外可見吸收光譜儀(UV 2450，Shimadzu，日本)，傅立葉紅外光譜儀(Nexus 470，Nicolet，美國)，場發(fā)射掃描電鏡(SIRON-100，F(xiàn)EI，美國)，微量注射泵(WZ-50C2，浙江大學醫(yī)藥儀器有限公司)，高壓電源(DW-P303-1ACF0，天津東文高壓電源廠)，Millipore 去離子水機(Milli-Q)。

1.2 方法

1.2.1 載藥電紡纖維膜的制備 將5 g 聚乙烯醇(PVA)顆粒在攪拌情況下緩緩加入到45 ml 超純水中，充分溶脹后升溫至90℃左右加速溶解，并保溫3 h，直到溶液不再含有微小顆粒，制得透明的PVA 溶液。再稱取0.1g 殼聚糖(CS)溶解在10 ml 超純水中，然后滴加3 滴乙酸，直到溶液澄清后滴加到40 ml 的上述PVA溶液中，制得PVA/CS 的前驅體溶液。分別加入1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、6.0% (為聚合物溶液總質量百分數(shù))的丹參素鈉(SAS)，在室溫下充分攪拌，混合均勻后于靜電紡絲儀器上紡絲。紡絲條件如下:電源電壓22 kV，針頭與接收基板之間的距離14 cm，供料速度1.0 ml/h，整個靜電紡絲過程在室溫下進行，收集10 h后即可在鋁膜上收集到PVA/CS/SAS 靜電紡絲纖維，于50℃真空干燥箱中干燥約3 h 至恒重，再置于PVC 塑料袋中封口保存待用。

1.2.2 形貌觀察 制得的納米纖維膜干燥后，噴金，掃描電鏡檢測，觀察納米纖維的形貌。

1.2.3 含藥量的測定 稱取干燥的60 mg 含有丹參素鈉的電紡纖維膜，加入到50 ml 的磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，在37℃恒溫水浴中振蕩72 h (70次/min)，離心10 min，吸取上層清液，用紫外可見吸收光譜儀在“丹參素鈉”的最大吸收波長λ=280 nm 處測定其吸光度。通過對比標準曲線獲得藥物的濃度。標準曲線可以通過檢測一系列標準濃度的丹參素鈉溶液的吸光度來進行繪制，方程為:A=0.124C +0.0008，R2=0.9999。式中A 是吸光度值，C 是丹參素鈉溶液的濃度，單位為mg/L。載藥纖維的含藥量按下式計算:含藥量=ml/m，其中ml為載藥纖維中丹參素鈉量，m 為電紡纖維膜質量。

1.2.4 體外釋藥曲線的測定 將干燥的載藥纖維膜(60 mg)置于盛有10 ml 磷酸緩沖溶液(PBS)(pH 7.4)的錐形瓶中，于37℃下恒溫振蕩，每隔一定時間取出1 ml 溶液，再向錐形瓶中加入等量的PBS 緩沖溶液，保持體積恒定。用紫外可見吸收光譜儀在“丹參素鈉”的最大吸收波長λ=280 nm 處測定其吸光度，由藥物標準曲線方程計算藥物濃度及釋藥量，再計算累積釋藥百分率并作累積釋藥曲線。累計釋藥率=mt/m×100%，其中mt為釋放t 時刻丹參素鈉的累積釋放質量，m 是載藥纖維中丹參素鈉的實際含量［11］。

2 結果與討論

2.1 不同載藥量電紡纖維膜的形貌表征 加有6% SAS 的紡絲溶液無法紡絲，噴出的全為小液滴。將加有1%、2%、3%、4% SAS 的電紡纖維于掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)4 種藥物含量的紡絲液均可以成纖，但SAS 為4%的纖維有串珠狀結構，且SAS 量越少其紡絲表面越光滑，串珠狀紡絲越少或沒有(圖1)。這是由于隨著SAS 量的增大，紡絲溶液可紡性變差，可能原因是PVA 和CS 均為大分子化合物，當加入小分子化合物SAS 時，使噴射流表面的電荷密度增大，從而噴射流載有更多的電荷，在電場中受到更大的牽伸力，導致噴射流不穩(wěn)定［12］。通過測量不同載藥量的電紡纖維的直徑，發(fā)現(xiàn)纖維直徑與載藥量成反比，但差別不大，平均直徑在280～390 nm 之間。同時可以觀察到，藥物載入電紡纖維之后，沒有固相分離現(xiàn)象，也沒有藥物結晶顆粒出現(xiàn)，反映了藥物與成纖聚合物載體之間良好的相容性。其具體原因可能是在電紡過程由于高壓電場力的作用，溶劑迅速揮發(fā)，PVA/CS 快速成纖，抑制了藥物在纖維成纖過程中的晶核的形成以及微晶聚結成顆粒的現(xiàn)象，使得藥物在電紡纖維高度均勻分散。

2.2 載藥電紡纖維膜的紅外表征 圖2 顯示了PVA/CS 電紡纖維膜、丹參素鈉(SAS)以及PVA/CS/SAS 電紡纖維膜的紅外光譜。PVA/CS 電紡纖維膜的紅外光譜中，在3428 cm-1處有強而寬的歸屬于羥基和氨基的伸縮振動峰，2923 cm-1處為C-H 的伸縮振動峰，1079 cm-1處為β-D 吡喃葡萄糖苷的伸縮振動峰［13］。圖2(b)是丹參素鈉的紅外譜圖:1660 cm-1處為羰基伸縮振動峰，1567 cm-1和1470 cm-1處為苯環(huán)上碳碳骨架伸縮振動峰，1267 cm-1處是羰基面內(nèi)彎曲振動吸收峰，芳環(huán)上的C-H 面外彎曲振動峰出現(xiàn)在917～672 cm-1處。而PVA/CS/SAS 電紡纖維膜的紅外光譜中則在1652 cm-1、1563 cm-1、1467 cm-1以及1265 cm-1等處出現(xiàn)吸收峰。這些吸收峰分別與丹參素鈉的特征峰相對應，但出現(xiàn)了一定的藍移，這可能是由于丹參素鈉中的羥基可與殼聚糖中的羥基、氨基及聚乙烯醇中羥基之間形成了較強的分子間的氫鍵。這些結果也表明，丹參素鈉分子與PVA 和CS 在載藥纖維中有很好的相容性。這對于載藥纖維的結構和性能穩(wěn)定十分有利。作為一種藥用成分，藥物的化學穩(wěn)定性是其能否有效發(fā)揮藥效的關鍵所在。由圖2 可見，丹參素鈉的歸屬峰在載藥纖維的圖譜中均可見，說明在經(jīng)歷電紡高壓過程后藥物仍保持了其化學結構。這也就說明丹參素鈉在成功載入PVA/CS 纖維中后，仍然保持原有的藥物活性。

圖1 不同理論含藥量的聚乙烯醇/殼聚糖/丹參素鈉電紡纖維膜的電鏡照片F(xiàn)ig.1 FESEM micrographics of PVA/CS/SAS electrospun nanofibers of different theoretic drug loadings

圖2 不同樣品的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of different samples

2.2 含藥量及體外釋藥曲線的測定結果 理論含藥量不同的載藥電紡纖維膜的實際含藥量見表1。

表1 理論含藥量不同的聚乙烯醇/殼聚糖/丹參素鈉電紡纖維膜的含藥量Table 1 Entrapment efficiency of SAS in PVA/CS/SAS electrospun nanofibers with different theoretic drug-loading amount

表1 顯示PVA/CS/SAS 電紡納米纖維膜的實際含藥量均小于理論值。造成實際含藥量小于理論值的原因可能是:在靜電紡絲的過程中，有部分丹參素鈉藥物與載體材料發(fā)生結合，不能游離出來，或在噴絲過程，藥物發(fā)生一定的泄漏;此外，藥物的加入也使紡絲液的穩(wěn)定性稍稍變差，使得紡絲液的紡絲性能下降，紡絲液在電紡過程有少量損失，最終載入纖維中藥物的量略微減少［14］。

圖3 是不同含藥量的電紡纖維膜的釋藥曲線。由圖可知，4 種載藥纖維膜在最初8 h 內(nèi)都存在突釋現(xiàn)象，之后藥物釋放逐漸減緩。突釋現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于載藥纖維膜在釋藥過程中的釋放方式不同造成的。載藥纖維中藥物的釋放首先發(fā)生在纖維的表層，形成了快釋區(qū)。當纖維表面的藥物釋放完畢后，纖維內(nèi)部的藥物要通過擴散，才能到達纖維表面進行釋放，由于擴散速率相對于釋放速率相對平緩，因而形成藥物的緩釋區(qū)，釋放速度也相對平緩［15］。理論含藥量越高，前期釋藥速率更快，原因是含藥量越高的納米纖維，纖維的直徑相對較小且表面的藥物分布比較多。但隨著纖維膜中含藥量增加，藥物釋放度相應有所提高。在36 h 內(nèi)，4 種載藥纖維膜均可實現(xiàn)持續(xù)釋放丹參素鈉。以上結果說明了以聚乙烯醇/殼聚糖為基質的藥物載體對丹參素鈉藥物具有一定的緩釋作用。

圖3 不同理論含藥量的聚乙烯醇/殼聚糖/丹參素鈉電紡纖維膜的體外釋藥曲線Fig.3 In vitro release profiles of SAS from PVA/CS/SAS electrospun nanofibers of different theoretic drug-loading amount

3 結論

采用靜電紡絲技術制備了負載不同含量丹參素鈉的聚乙烯醇/殼聚糖載藥電紡纖維膜，掃描電鏡觀察制備的電紡纖維平均直徑在280～390 nm 之間。紅外光譜表明，丹參素鈉已經(jīng)成功載入電紡纖維中，并且仍然保持原有的藥物活性;通過對載藥纖維的釋藥性能考察發(fā)現(xiàn)，載藥纖維能較好地實現(xiàn)丹參素鈉的緩控釋放，有望應用于皮膚局部給藥體系或傷口敷料領域。

［1］RUSSO G，LAMBERTI G.Electrospinning of drugloaded polymer systems:Preparation and drug release［J］.J Appl Polym Sci，2011，122(6):3551-3556.

［2］GAUTAM S，DINDA A K，MISHRA N C.Fabrication and characterization of PCL/gelatin composite nanofibrous scaffold for tissue engineering applications by electrospinning method ［J］.Mat Sci Eng C，2013，33(3):1228-1235.

［3］IGNATOVA M，RASHKOV I，MANOLOVA N.Drug-loaded electrospun materials in wounddressing applications and in local cancer treatment［J］.Expert Opin Drug Deliv，2013，10(4):469-483.

［4］WANG Wenjun，WU Xianzhong，YAO Zhi(王文俊，吳咸中，姚 智).The influence of emodin and Danshensu on monocyte's secretion of inflammatory cytokines［J］.Chinese Journal of Immunology(中國免疫學雜志)，1995，11(6):370-372.(in Chinese)

［5］SU Qinghe，YANG Minjie，ZHOU Hongmei，et al(蘇 青 和，楊 敏 杰，周 紅 梅，等).Effect of Danshensu on the burn wounds fibroblasts cells and collagen synthesis ［J］.Medical Journal of Communications(交通醫(yī)學)，2003，17(6)，666-667.(in Chinese)

［6］WANG Yimin，WEI Fukang，LIU Min，et al (王益民，韋 福 康，劉 敏，等).Effect of salvia miltiorrhiza on autocrining growth factor by fibroblasts cultured in vitro［J］.Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery(中國修復重建外科雜志)，2002，16(6)，408-410.(in Chinese)

［7］JAYAKUMAR R，PRABAHARAN M，KUMAR P T S，et al.Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications［J］.Biotechnol Adv，2011，29 (3):322-337.

［8］WANG T，ZHU X K，XUE X T，et al.Hydrogel sheets of chitosan，honey and gelatin as burn wound dressings［J］.Carbohyd Polym，2012，88(1):75-83.

［9］TCHEMTCHOUA V T，ATANASOVA G，AQIL A，et al.Development of a chitosan nanofibrillar scaffold for skin repair and regeneration ［J］.Biomacromolecules，2011，12(9):3194-3204.

［10］ARCHANA D，SINGH B K，DUTTA J，et al.In vivo evaluation of chitosan-PVP-titanium dioxide nanocomposite as wound dressing material ［J］.Carbohydr Polym，2013，95(1):530-539.

［11］RUJITANAROJ P O，POMPHA N，SUPAPHOL P.Wound-dressing materials with antibacterial activity from electrospun gelatin fiber mats containing silver nanoparticles ［J］.Polymer，2008，49(21):4723-4732.

［12］RENEKER D H，YARIN A L，F(xiàn)ONG H，et al.Bending instability of electrically charged liquid jets of polymer solutions in electrospinning［J］.J Appl Phys，2000，87(9):4531-4547.

［13］ZHEN Hongpeng，YANG Dongzhi，GUO Suang，et al(甄洪鵬，楊冬芝，郭 爽，等).Preparation and sustained release in vitro of ofloxacin loaded in chitosan/poly(vinyl alcohol)blend nanofibrous mats ［J］.Journal of Beijing University of Chemical Technology(北京化工大學學報)，2007，34(3):271-274.(in Chinese)

［14］NIE H，WANG C H.Fabrication and characterization of PLGA/Hap composite scaffolds for delivery of BMP-2 plasmid DNA ［J］.J Control Release，2007，120(1-2):111-121.

［15］PANYAM J，DALI M M，SAHOO S K，et al.Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D，L-lactide-co-glycolide)nanoand microparticles［J］.J Control Release，2003，92(1-2):173-187.