楊 光，高萬峰，葉圣權(quán)，曾憲陽

胞膜凹是細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷而成的直徑為50～100 nm 的燒瓶狀小凹，存在于多種終末分化細(xì)胞中，通過參與細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號傳導(dǎo)行使重要生理功能。小凹蛋白-1(Caveolin-1)是其重要的標(biāo)記結(jié)構(gòu)蛋白，通過磷酸化/去磷酸化方式與多種信號分子協(xié)同作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的一種重要修飾基因。近年研究表明，Caveolin-1 在乳腺癌組織中呈不同程度的表達(dá)，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其與乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系仍存在爭議［1］。本研究應(yīng)用Envision 免疫組織化學(xué)法和Western 印跡法檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、乳腺纖維腺瘤及正常乳腺組織中Caveolin-1 的表達(dá)，探討其與乳腺癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及對預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本取自2000-08至2007-05 武警遼寧總隊醫(yī)院和中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院切除的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、乳腺纖維腺瘤及正常乳腺組織標(biāo)本168例，其中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌96例，乳腺纖維腺瘤52例，癌旁正常組織20例?；颊呔鶠榕裕挲g32～82歲，中位年齡54.3歲。所有病例均為首次發(fā)病，術(shù)前患者均未接受過抗腫瘤治療，術(shù)后所有標(biāo)本的石蠟切片均參照文獻(xiàn)［2］診斷標(biāo)準(zhǔn)，并由高年資病理醫(yī)師做出明確診斷。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌96例組織學(xué)分級參照Elson and Ellis 半定量三級分類法:Ⅰ級48例，Ⅱ級36例，Ⅲ級12例;臨床TNM分期采用NCCN(2010)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行界定［3］:Ⅰ期28例，Ⅱ期20例，Ⅲ+IV 期48例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者66例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。ER(+)者83例，(-)者13例;PR(+)者88例，(-)者8例;HER-2(+)者62例，(-)者34例;腫瘤直徑≤2 cm 者46例，2～5 cm 者32例，＞5 cm 者18例。另取其中20例新鮮乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、20例乳腺纖維腺瘤標(biāo)本及癌旁正常乳腺組織標(biāo)本，切除后立即放入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 兔源性Caveolin-1 多克隆抗體購自Abcam 公司，即用型非生物素免疫組織化學(xué)EnVisionTM 試劑盒(兔/鼠雙標(biāo))和DAB 酶底物顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。兔抗人多克隆β-actin 抗體購自Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 標(biāo)本按照常規(guī)方法脫蠟，石蠟包埋組織塊經(jīng)4 μm 連續(xù)切片，EnVision 法檢測Caveolin-1 的表達(dá)，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。已知乳腺癌陽性切片做陽性對照，以PBS 液代替一抗作為陰性對照。采用雙盲法進(jìn)行染色結(jié)果判定。每張切片均由兩位高年資病理科診斷醫(yī)師獨(dú)立閱片，兩位一致肯定為陽性者方視為陽性。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，每個視野數(shù)100個細(xì)胞。按照著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)(%)計算評分。其中著色強(qiáng)度為“-”(不著色)者記為0 分，“+”(淡黃色)者記為1 分，“++”(棕黃色)者記為2 分，“+++”(棕褐色)者記為3 分;陽性細(xì)胞數(shù)＜5%時記為0 分，5%～25%時記為1 分，26%～50%時記為2 分，51%～75%時記為3 分，76%～100%時記為4 分。著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)的評分?jǐn)?shù)相乘即為染色結(jié)果最后得分，平均得分≥6 分者即判定為陽性，＜6 分者即為陰性。

1.3.2 Western 印跡 4℃下取等量標(biāo)本(1～2 g)，加大約5 倍濕重的裂解緩沖液，粉碎勻漿，4℃靜置24 h，低溫高速離心。取上清為總蛋白。Bradford 法測定蛋白濃度，取等量蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。取下凝膠40V 轉(zhuǎn)印2 h，封閉后，與抗caveolin-1(1∶400)和抗β-actin(1∶400)孵育過夜;經(jīng)TBS、TTBS 洗滌后與二抗(1∶50)室溫下孵育1 h，TTBS、TBS 洗滌，DAB 顯色。結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(Chemilmager 5500，美國)采集，進(jìn)行灰度值測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prism 5.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。Caveolin-1 在各組乳腺組織中的陽性表達(dá)率比較以及Caveolin-1 與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 確切概率法，顯著性水準(zhǔn)=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 方法和Log-rank 檢驗(yàn)。采用t 檢驗(yàn)分析Western 印跡實(shí)驗(yàn)中Caveolin-1 的表達(dá)情況。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Caveolin-1 在乳腺癌及非癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，Caveolin-1 的陽性表達(dá)產(chǎn)物為胞核和胞漿均見黃色-棕褐色顆粒，在正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的陽性表達(dá)率分別為95.0%，53.8%和19.8%，呈逐漸下降趨勢，3組間比較及兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖1 和表1)。

圖1 Caveolin-1 在正常乳腺及腫瘤組織中的表達(dá)(Envision 染色，×400)

表1 Caveolin-1 在乳腺癌、乳腺纖維腺瘤及正常乳腺組織中的表達(dá) (n;%)

2.2 Caveolin-1 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Caveolin-1 在乳腺癌中的表達(dá)水平隨臨床TNM 分期的遞增(P=0.044)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)(P=0.039)以及HER-2 表達(dá)(P=0.014)的減弱而逐漸降低，各組間有顯著相關(guān)性;與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級及ER/PR 表達(dá)等無關(guān)(表2)。

表2 Caveolin-1 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性 (n;%)

2.3 Caveolin-1 的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性分析 免疫組化結(jié)果顯示，在Caveolin-1(+)表達(dá)的患者中，其5年生存率明顯高于Caveolin-1(-)表達(dá)的患者組(χ2=5.837，P=0.018)。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示Caveolin-1(+)表達(dá)的病例預(yù)后明顯好于Caveolin-1(-)表達(dá)的病例(Log-rank 檢驗(yàn)，P=0.027)。

2.4 Western 印跡法測定結(jié)果 應(yīng)用單克隆抗體Caveolin-1 檢測20例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁正常乳腺組織中Caveolin-1 的表達(dá)情況，灰度值測定結(jié)果示癌旁正常乳腺組織Caveolin-1 的表達(dá)明顯高于乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織(P＜0.01，圖2)。

圖2 Western blot 檢測Caveolin-1 在乳腺腫瘤及正常組織中的表達(dá)情況

3 討 論

Caveolin-1 在大多數(shù)正常細(xì)胞中表達(dá)豐富，除參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)吞、血管生成、脂質(zhì)平衡以及信號傳導(dǎo)等生理過程，而且與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

近年研究表明，Caveolin-1 的突變在多種腫瘤細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用，其基因表達(dá)存在組織特異性。文獻(xiàn)［4-6］研究表明，Caveolin-1 在多種腫瘤細(xì)胞(如結(jié)腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、子宮內(nèi)膜癌等)中表達(dá)下調(diào)甚至缺如，高表達(dá)Caveolin-1 則能抑制惡性細(xì)胞生長性狀，提示其在腫瘤的生長中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。近年來的基因敲除及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果也傾向于Caveolin-1 是腫瘤抑制基因，且基因定位于7q31.1 的FRA7G 位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染Caveolin-1 基因能明顯抑制某些腫瘤的惡性表型［7］。但在另一些腫瘤研究中(如食管癌、前列腺癌、肺腺癌、膀胱癌等)則發(fā)現(xiàn)Caveolin-1 表達(dá)明顯上調(diào)，并與腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及病理分級密切相關(guān)，表現(xiàn)為致癌基因作用［8，9］。這些研究說明，Caveolin-1 可能扮演致癌基因的角色協(xié)同參與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其具體作用機(jī)制及意義尚需進(jìn)一步揭示。

本研究結(jié)果顯示，Caveolin-1 在乳腺癌組織中的表達(dá)率(19.8%)明顯低于良性乳腺組織(53.8%)和正常乳腺組織(95.0%)，且Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Caveolin-1 在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，這一結(jié)果與Caveolin-1 在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌中表達(dá)降低的研究結(jié)果相一致，符合其在某些腫瘤的生長中起負(fù)調(diào)節(jié)作用的條件之一。Caveolin-1 基因啟動子甲基化被證明是Caveolin-1 蛋白表達(dá)下調(diào)的主要可能性因素［10］。筆者觀察到Caveolin-1 在乳腺癌中的表達(dá)下調(diào)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。此外，對比不同臨床分期的乳腺癌組織，其Caveolin-1 蛋白的表達(dá)水平亦不盡相同，分期越高，腫瘤發(fā)展越活躍，Caveolin-1 的表達(dá)則越低，反之亦然，進(jìn)一步說明Caveolin-1 蛋白具有抑制腫瘤生長和發(fā)展的活性。目前認(rèn)為，Caveolin-1 主要通過其架構(gòu)區(qū)發(fā)揮其抑癌因子的作用。Caveolin-1 架構(gòu)區(qū)通過負(fù)性調(diào)控PDGF、ECG、FGF、Raf、-Src 酪氨酸激酶、ERK-2 活性，從而激活p42/44MAPK 及其下游的Jun、Fos 等核轉(zhuǎn)錄因子，抑制PKCs 酪氨酸激酶磷酸化進(jìn)而阻止細(xì)胞周期CyclinD-1 的表達(dá)。在腫瘤發(fā)生過程中，Caveolin-1 表達(dá)下調(diào)，極有可能也降低了Caveolin-1 架構(gòu)區(qū)對這些活化因子的抑制，從而影響到腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其Caveolin-1 的表達(dá)率僅為18.2%，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)率為93.3%，且隨著患者5年生存率的遞增，Caveolin-1 的表達(dá)隨之下調(diào)，說明Caveolin-1 在乳腺癌的轉(zhuǎn)移和浸潤中扮演著重要角色。與Williams等［11］的研究結(jié)果相一致。這可能與Caveolin-1 通過阻止乳腺上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的分泌來抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，或通過Caveolin-1 的突變、啟動子的甲基化而失活，進(jìn)而在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中失去作用有關(guān)。此外，筆者還觀察到表皮生長因子受體-2(HER-2)的表達(dá)水平與Caveolin-1 的表達(dá)顯著相關(guān)，但兩者在影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中是否相互作用或發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。從臨床診斷和治療角度考慮，針對Caveolin-1 的表達(dá)狀態(tài)來評估患者病情以及尋找靶向治療藥物可能成為乳腺癌未來的主要研究方向。

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