崔茹鵬，沈文，魯海富，孫延鳴

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

干擾素刺激基因 15（IFN－stimulated gene，isg15），編碼蛋白為ISG15。但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，人的ISG15所編碼的氨基酸序列實(shí)際包含165個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約17.89 ku，由2個(gè)串聯(lián)的與泛素同源的氨基酸序列組成，2序列間由脯氨酸殘基橋接，氨基端及羧基端與泛素同源性分別為29%、31%，故又稱ISG15為類泛素蛋白（ubiquitin like protein，Ubls）［1］。脊椎動(dòng)物的多種細(xì)胞在受到干擾素、細(xì)菌脂多糖（LPS）、病毒感染等刺激后，ISG15可被高度誘導(dǎo)表達(dá)［2］。研究已證實(shí)，類泛素ISG15以及其蛋白質(zhì)共價(jià)修飾對(duì)刺激細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞抗病毒作用、促進(jìn)白細(xì)胞趨化作用等先天免疫功能的過程中有著重要的作用［3－4］。細(xì)胞外的ISG15具有細(xì)胞因子的活性，參與細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)［5］。細(xì)胞內(nèi)的ISG15在調(diào)節(jié)干擾素信號(hào)通路中起到了重要的作用［6］。目前已有一些對(duì)于ISG15功能的研究，但主要集中在人和小鼠上，其中對(duì)羊ISG15的研究更少，目前在羊上該基因是否也具有這些功能還有待進(jìn)一步的研究。

本研究利用綿羊外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）克隆獲得了ISG15基因，將該基因克隆到原核表達(dá)載體p ET28a（＋）中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）［7－10］，通過優(yōu)化表達(dá)條件，得到了ISG15的高效表達(dá)產(chǎn)物，且該表達(dá)產(chǎn)物易于純化，為進(jìn)一步研究綿羊ISG15的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、DH5α和p ET－28a（＋）載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Taq DNA酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和Eco RⅠ、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、p MD18－T、蛋白質(zhì) Marker、IPTG 購(gòu)自 Fermentas公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海生化試劑廠。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）5只。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中綿羊ISG15的基因序列（登錄號(hào)：FJ844480）和 PET28a（＋）多克隆位點(diǎn)，利用primer 5軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

上游引物 P1為：5′－GAATTCATGGGCG－GGGACCTGA－3′，帶有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和起始密碼子；

下 游 引 物 P2 為：5′－AAGCTTTTTGCTACAACTTTATTCACTGCG－3′，帶有 HindⅢ酶切位點(diǎn)和終止密碼子。

1.2.2細(xì)胞總RNA的提取

從頸靜脈無(wú)菌采取健康綿羊抗凝外周血，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離出PBMC，經(jīng)PBS洗滌3次，用TRIzol試劑按照說明書提取總RNA：將PBMC 4℃4000 r／min離心5 min，棄上清，加入1 mL TRIzol試劑，混勻，室溫靜置10 min，充分裂解，加入200μL氯仿，混勻，室溫靜置5 min，4℃12000 r／min離心15 min；棄上清加入750 mL／L乙醇1 mL，振蕩懸浮，7500 r／min離心5 min，棄上清干燥，加入無(wú)RNA酶的DEPC水中，于－70℃保存。

1.2.3 ISG15 cDNA的克隆及測(cè)序

按照RT－PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作：取上述制備的總RNA 1μg，加入20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以O(shè)ligo（d T）為引物，于42℃50 min，95℃5 min，終止反應(yīng)。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL加入到20μL的PCR反應(yīng)體系，以P1、P2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃5 min，充分變性后進(jìn)入循環(huán)體系：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，取PCR產(chǎn)物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

將RT－PCR產(chǎn)物回收純化，直接與p MD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)的菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)Eco RⅠ、HindⅢ雙酶切和PCR進(jìn)行初步鑒定，并委托北京六合華大基因科技有限公司對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，將鑒定正確的重組陽(yáng)性質(zhì)粒命名為p MD18－ISG15。

1.2.4原核表達(dá)載體pET28a－ISG15的構(gòu)建與鑒定

將上述重組質(zhì)粒p MD18－ISG15用P1、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并回收純化，將純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體p ET－28a分別用EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切，分別回收ISG15和pET－28a（＋）的目的基因片段，并用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET28a－ISG15，然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切和PCR進(jìn)行初步鑒定，并委托北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，用DNAStar軟件分析插入片段的正確性，將鑒定正確的重組陽(yáng)性質(zhì)粒命名為p ET28a－ISG15。

1.2.5 pET28a－ISG15的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，接種于2×LB培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)過夜，次日按1%比例轉(zhuǎn)種于同樣培養(yǎng)液，至A600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入IPTG（終濃度為1.0 mmol／L）進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后離心收集菌體，溶于2×SDS凝膠加樣 緩 沖 液 （50 mmol／L Tris－HCl、100 mmol／L DTT、2%SDS、10%甘油）中，100℃5 min，然后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，分析目的蛋白表達(dá)情況，同時(shí)設(shè)空載體和不加IPTG的對(duì)照。

1.2.6表達(dá)產(chǎn)物的純化

將表達(dá)產(chǎn)物用Ni2＋－NTA樹脂進(jìn)行純化。大量收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，超聲破碎，將上清用0.45 μm濾膜過濾，濾液裝入Ni2＋－NTA樹脂層析柱中，用洗脫液多次重懸樹脂，取洗脫液進(jìn)行SDSPAGE，分析目的蛋白的純化效果。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR擴(kuò)增

以綿羊PBMC細(xì)胞總RNA為模板，經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，在分子量大小約541 bp位置可見清晰的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

DNA測(cè)序結(jié)果與Gen－Bank中報(bào)道羊的序列相似性為98.48%（測(cè)序結(jié)果略），說明已經(jīng)成功克隆了綿羊ISG15基因。

圖1 ISG15基因的RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The RT－PCR amplification results of the ISG15 gene

2.2 重組質(zhì)粒的酶切、PCR及測(cè)序鑒定

將重組質(zhì)粒p ET28a－ISG15經(jīng)EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切鑒定及PCR鑒定，得到與目的基因大小一致的片段（圖2、3），并且將重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明編碼ISG15的基因已經(jīng)正確地插入到原核表達(dá)載體p ET－28a的克隆位點(diǎn)（測(cè)序結(jié)果略）。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a－ISG15的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmid pET28a－ISG15

圖3 重組質(zhì)粒pET28a－ISG15的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 The restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pET28a－ISG15

2.3 ISG15融合蛋白的表達(dá)與鑒定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，用終濃度為1.0 mmol／L IPTG誘導(dǎo)4 h后收集菌體，經(jīng)裂解后取上清進(jìn)行SDS－PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示目的條帶為25 ku，與預(yù)期結(jié)果一致，而非重組的p ET－28a（＋）中未見明顯條帶，說明重組質(zhì)粒p ET28a－ISG15獲得了表達(dá)（圖4）。

圖4 pET28a－ISG15在E.coli BL21中表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.4 The expression product of pET28a－ISG15 in E.coli BL21 by SDS－PAGE

2.4 表達(dá)蛋白的純化

目的蛋白經(jīng)Ni2＋－NTA樹脂純化后，得到單一的條帶，純化效果較好（圖5）。

圖5 pET28a－ISG15表達(dá)純化產(chǎn)物的檢測(cè)Fig.5 The purification of pET28a－ISG15 expressed product by SDS－PAGE analysis

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中的綿羊ISG15基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用 RT－PCR［11－12］的方法克隆得到綿羊ISG15基因，并將綿羊ISG15基因克隆到高效表達(dá)載體p ET－28a（＋）中進(jìn)行表達(dá)。本試驗(yàn)選用p ET－28a（＋）載體作為表達(dá)載體，主要是由于p ET－28a的MCS前面沒有信號(hào)肽，直接用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并且p ET－28a帶有his標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化工作。本試驗(yàn)采用Ni2＋－NTA樹脂對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化，由于帶有his標(biāo)簽的目的蛋白能夠與Ni2＋－NTA樹脂特異性結(jié)合，分離的目的蛋白純度較高，而且Ni2＋－NTA樹脂可再生反復(fù)利用，因此本試驗(yàn)采用Ni2＋螯合親和層析法［13］將目的蛋白純化。另外，為了提高目的蛋白的表達(dá)量，本試驗(yàn)對(duì)IPTG的不同用量及不同誘導(dǎo)時(shí)間分別進(jìn)行了篩選與優(yōu)化，找到了最佳表達(dá)條件，即當(dāng)IPTG為1.0 mmol／L且誘導(dǎo)4 h時(shí)，ISG15融合蛋白獲得了高效表達(dá)，表達(dá)的蛋白分子量為25 ku，為今后對(duì)該基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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