石曉明 吳勝春 唐雷 楊永賓 呂柏楠

研究證實(shí)，水通道蛋白1(AQP1)在宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均存在高表達(dá)［1－4］，對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、黏附、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為都具有調(diào)節(jié)作用，已成為惡性腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)。但迄今關(guān)于AQP1的具體作用機(jī)制尚未完全闡明，有關(guān)AQP1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)及意義的研究筆者也不多見(jiàn)。因此，本研究檢測(cè) AQP1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)，對(duì)結(jié)腸癌組織中這些蛋白質(zhì)之間的關(guān)系進(jìn)行分析，對(duì)AQP1在結(jié)腸癌中的作用和意義進(jìn)行了初步探討。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2007年9月至2010年10月在我院普外科就診患者54例，其中男40例，女14例;年齡38～74歲，中位年齡58歲。所有患者均手術(shù)并有術(shù)后確診病理。取原發(fā)癌石蠟標(biāo)本，并取其中40例的癌旁組織標(biāo)本。

1．2 免疫組化染色(SP 法)檢測(cè) AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá) 兔抗人 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1多克隆抗體均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒為邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。均采用SP法分別對(duì)腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行各指標(biāo)的免疫組化染色。石蠟標(biāo)本連續(xù)4 μm切片，脫蠟水化后3%過(guò)氧化氫孵育，蒸餾水沖凈后以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡進(jìn)行抗原修復(fù)。嚴(yán)格按免疫組化試劑盒要求進(jìn)行操作:工作液封閉、加入一抗、孵育并沖洗后依次加二抗工作液、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復(fù)染后進(jìn)行脫水，最后中性樹(shù)脂封片，分別進(jìn)行HE和免疫組化染色。

1．3 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由兩位病理學(xué)醫(yī)師雙盲閱片判斷免疫組化結(jié)果。每張石蠟切片在鏡下隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每視野計(jì)數(shù) 100 個(gè)細(xì)胞，AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 以細(xì)胞漿呈黃色為染色陽(yáng)性，按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率分別進(jìn)行記分。按著色強(qiáng)度記分:無(wú)著色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕黃色記3分。按腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞率記分:陽(yáng)性細(xì)胞≤5%(0分)，6% ～25%(1分)，26% ～50%(2分)，51% ～75%(3分)，≥76%為(4分)。兩種記分結(jié)果相乘為0～1記為陰性(－)，2～3記為弱陽(yáng)性(+)，4～7陽(yáng)性(++)，≥8強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 8．0統(tǒng)計(jì)軟件，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 結(jié)腸癌和癌旁組織中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度 45例結(jié)腸癌組織中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為 75．93%、64．81%、77．78%、46．30%;癌旁組織中這4種蛋白質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性率分別為22．50%、37．50%、50．00%、70．00%。經(jīng)比較，AQP1、MMP-2、MMP-9 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均較癌旁組織增強(qiáng)，而TIMP-1在癌旁組織中表達(dá)高于癌組織(P ＜0．05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)腸癌和癌旁組織AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)情況 例

2．2 結(jié)腸癌和癌旁組織中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的關(guān)系 AQP1與MMP-2、AQP1與MMP-9間表達(dá)強(qiáng)度量正相關(guān)(r值分別為 0．4030 和 0．3874，P ＜0．01)，MMP-2 與TIMP-1、MMP-9與 TIMP-1之間表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r值分別為－0．3176和 －0．4728，P ＜0．05)。

3 討論

近年來(lái)結(jié)腸癌的發(fā)生率在我國(guó)明顯上升，作為一種全身性疾病嚴(yán)重威脅群眾的健康。由于該病起病比較隱匿、多無(wú)明顯特異性癥狀，患者就診時(shí)經(jīng)常已處于晚期，治療效果不佳，預(yù)后差。而有關(guān)影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的基因目前還不完全明確。因此，尋找影響結(jié)腸癌進(jìn)展的基因?qū)τ诖_定新的腫瘤標(biāo)志物、分析結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制、尋找腫瘤基因治療靶標(biāo)有重要意義。AQP1即為目前受到關(guān)注的基因之一，AQP1為水通道蛋白家族的成員之一，基因定位于染色體7p14，蛋白質(zhì)分子量為28 kD，以四聚體形式存在于細(xì)胞膜上。AQP1的主要功能為轉(zhuǎn)運(yùn)水分子，還可轉(zhuǎn)運(yùn)甘油及其他小分子物質(zhì)［5］。國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)AQP1在宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均存在高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，導(dǎo)致腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移［1－4］。體外實(shí)驗(yàn)表明，抑制其表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［4，6］。說(shuō)明AQP1與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。本研究顯示，AQP1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0．01)，說(shuō)明AQP1與結(jié)腸癌關(guān)系密切，對(duì)其功能進(jìn)行分析可為結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制研究提供依據(jù)。

AQP1的調(diào)控機(jī)制目前還不完全清楚。但有研究表明AQP1可以通過(guò)影響p38MAPK通路的活性而使膀胱癌細(xì)胞的侵襲遷移活性發(fā)生改變［7］。目前關(guān)于AQP1與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)，故本研究對(duì)AQP1和反應(yīng)腫瘤細(xì)胞侵襲黏附能力的 MMP-2、MMP-9、TIMP-1之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。MMPs可以降解細(xì)胞外環(huán)境中的蛋白質(zhì)、破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的體內(nèi)屏障，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移至其他部位［8］。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，可直接促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。TIMP1則是 MMP-2、MMP-9的抑制物，可以抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［10］。本研究發(fā)現(xiàn)AQP1與MMP-2、AQP1與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，提示AQP1可能通過(guò)促進(jìn)MMP-2、MMP-9表達(dá)而導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、黏附能力增強(qiáng)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)AQP1與TIMP-1之間有關(guān)。我們推測(cè)這可能是在結(jié)腸癌細(xì)胞中AQP1只能調(diào)控部分侵襲相關(guān)因子，且AQP1、TIMP-1對(duì)腫瘤細(xì)胞所起的調(diào)控作用位于侵襲黏附過(guò)程的不同水平，所以關(guān)系并不明顯。

本研究證實(shí)了AQP1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高，AQP1可能通過(guò)影響MMP-2、MMP-9的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。但我們也發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中影響腫瘤細(xì)胞侵襲功能的基因網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)極其復(fù)雜，有關(guān)AQP1的具體功能尚待進(jìn)一步深入研究。

1 Shi YH，Chen R，Talafu T，et al．Significance and expression of aquaporin 1，3，8 in cervical carcinoma in Xinjiang Uygur women of China．Asian Pac J Cancer Prev，2012，13:1971-1975．

2 裴海平，劉卓，黃林生，等．水通道蛋白1和3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其意義．中華胃腸外科雜志，2011，14:275-278．

3 王楠，肖英紅，王宇，等．利用組織芯片檢測(cè)水通道蛋白1在乳腺癌組織中的表達(dá)．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15:402-403．

4 Xie Y，Wen X，Jiang Z，et al．Aquaporin 1 and aquaporin 4 are involved in invasion of lung cancer cells．Clin Lab，2012，58:75-80．

5 胡科，楊繼元．水通道蛋白1與腫瘤．微循環(huán)學(xué)雜志，2011，21:81-83．

6 Jiang Y．Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration．IUBMB Life，2009，61:1001-1009．

7 Pan XY，Guo H，Han J，et al．Ginsenoside Rg3 attenuates cell migration via inhibition of aquaporin 1 expression in PC-3M prostate cancer cells．Eur J Pharmacol，2012，683:27-34．

8 Pytliak M，Vargová V，Mechírová V．Matrix metalloproteinases and their role in oncogenesis:a review．Onkologie，2012，35:49-53．

9 Zhang XX，F(xiàn)u Z，Zhang Z，et al．Microcystin-LR Promotes Melanoma Cell Invasion and Enhances Matrix Metalloproteinase-2/-9 Expression Mediated by NF-κB Activation．Environ Sci Technol，2012，46:11319-11326．

10 Bourboulia D，Stetler-Stevenson WG．Matrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs):Positive and negative regulators in tumor cell adhesion．Semin Cancer Biol，2010，20:161-168．