陳雁虹，蓋仁華，吳洪海

(浙江大學(xué)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2.藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，浙江杭州 310058)

全反式維A酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的一種代謝衍生物，對(duì)細(xì)胞增殖、分化和成熟具有調(diào)節(jié)作用[1]，是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育和各種生理活動(dòng)必不可少的重要物質(zhì)。由于能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡，ATRA被廣泛用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[2]，目前臨床已嘗試用于實(shí)體瘤的治療[3]。但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，ATRA會(huì)引起被稱為維A酸綜合征的皮膚干燥、口唇干裂、頭痛、肌肉骨骼疼痛等[4]。骨髓抑制壞死[5]和肝毒性等不良反應(yīng)，亦有導(dǎo)致高甘油三酯血癥的報(bào)道[6]。本研究通過(guò)觀察大鼠連續(xù)4周ig給予ATRA的長(zhǎng)期毒性反應(yīng)，初步確定其主要毒性靶器官及毒性反應(yīng)性質(zhì)和程度，為臨床用藥的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

ATRA由陜西森弗生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào):20090514，純度99.6%，避光保存于 －20℃，使用前用0.5%羧甲纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成混懸均勻溶液。CMC-Na和EDTA-K2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):30036328。生化試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司。凝血試劑盒購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司。全血細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑包購(gòu)自北京西門(mén)子醫(yī)療診斷設(shè)備有限公司。肝素鈉購(gòu)自BioSharp公司。甲醛和二甲苯等試劑購(gòu)自上海申翔化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Cobas C311全自動(dòng)生化儀(德國(guó)羅氏公司);CA-550全自動(dòng)血凝分析儀(日本Sysmex醫(yī)用電子有限公司);ADVIA 2120全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀(德國(guó)Siemens醫(yī)療系統(tǒng)集團(tuán));5424離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf股份公司);AL104電子天平(上海Metler Toledo儀器有限公司)。EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2235組織切片機(jī)、ASP300組織脫水機(jī)和DM4000電子顯微鏡(德國(guó)Leica儀器有限公司)。

1.3 大鼠

SPF級(jí) SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g。由浙江省實(shí)驗(yàn)大鼠中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)20080033，動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(浙)2003-0098，溫度20～24℃，濕度40%～70%，明暗交替12 h/12 h，換氣次數(shù)為10～20 h－1，大鼠自由飲水、攝食。

1.4 分組和給藥

SD大鼠80只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為溶劑對(duì)照組，ATRA 10，50 和 250 mg·kg－1組，每組20只，雌雄各半。大鼠每日上午 ig給予ATRA，給藥容積為 10 ml·kg－1，每天 1 次，連續(xù)4周。溶劑對(duì)照組給予同等體積0.5%CMC-Na溶液。

1.5 給藥期間對(duì)大鼠的觀察

給藥期間每日對(duì)大鼠的行為體征、飲食、糞便、呼吸和自發(fā)活動(dòng)等一般狀況進(jìn)行觀察;每7 d稱量1次體質(zhì)量和攝食量。

1.6 血液血常規(guī)、血液生化和凝血功能檢查

停藥后第1天和第15天，ATRA和溶劑對(duì)照組大鼠禁食12 h后，分別取部分大鼠，雌雄各半，10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈采血，進(jìn)行血常規(guī)、血液生化和凝血功能檢測(cè)。

1.7 臟器系數(shù)計(jì)算和病理組織學(xué)的檢查

停藥后第1天和第15天分別進(jìn)行大鼠尸檢后，取對(duì)心、肝、脾、肺和腎等主要臟器進(jìn)行稱量，計(jì)算其臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。各臟器用10%中性甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)病理取材、制片和HE染色，顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATRA對(duì)大鼠一般狀況的影響

ATRA 250 mg·kg－1組給藥 14 d 后，大鼠出現(xiàn)毛色黯淡、豎毛、眼瞼部脫毛出血和呼吸急促等癥狀，四肢出現(xiàn)不同程度的骨折現(xiàn)象，自主活動(dòng)明顯減少;給藥18 d后出現(xiàn)大鼠死亡，至給藥期結(jié)束，大鼠有4只死亡，且都為雄性。ATRA 10和50 mg·kg－1組毛色、自主活動(dòng)和體征反應(yīng)等均無(wú)異常，未出現(xiàn)大鼠死亡。

2.2 ATRA對(duì)大鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

如表1和表2所示，ATRA 250 mg·kg－1組給藥1周后體質(zhì)量逐漸減輕，與溶劑對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，ATRA 10 和 50 mg·kg－1組體質(zhì)量增長(zhǎng)較為緩慢，ATRA 50 mg·kg－1組第2周與溶劑對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)，其余組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。同時(shí)與溶劑對(duì)照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組攝食量逐漸減少(P＜0.05)，ATRA 10 和 250 mg·kg－1組攝食量無(wú)明顯變化。

Tab.1 Effect of all-trans retinoic acid(ATRA)on body mass of rats

Tab.2 Effect of ATRA on food intake in rats

2.3 ATRA對(duì)血常規(guī)指標(biāo)的影響

如表3所示，停藥后第1天，各組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)均較溶劑對(duì)照組有升高的趨勢(shì);ATRA 250 mg·kg－1組中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯升高，嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積和血小板數(shù)明顯降低(P＜0.01);ATRA 10和50 mg·kg－1組中性粒細(xì)胞明顯升高(P＜0.05);ATRA 50 mg·kg－1組紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積和血小板數(shù)明顯降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯升高(P＜0.01);ATRA 10 mg·kg－1組紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積明顯降低(P＜0.01)，網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯升高(P＜0.05)。其中，ATRA對(duì)紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響存在一定的劑量依賴性。停藥后第15天，ATRA各組大鼠中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積和血小板有不同程度的恢復(fù)，而較溶劑對(duì)照組，ATRA 250 mg·kg－1組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度仍有明顯的降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞有明顯的升高(P＜0.01);ATRA 50 mg·kg－1組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有明顯的降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞有明顯的升高(P＜0.01);ATRA 10 mg·kg－1組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血紅蛋白濃度明顯降低(P＜0.01)。

2.4 ATRA對(duì)血生化指標(biāo)的影響

如表4所示，停藥后第1天，與溶劑對(duì)照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組總蛋白、白蛋白、總膽紅素和肌酐明顯下降，球蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和甘油三酯明顯上升(P＜0.01)，同時(shí)葡萄糖明顯升高，肌酸激酶明顯降低(P＜0.05)。ATRA 50 mg·kg－1組白蛋白和肌酸激酶明顯降低，球蛋白、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和甘油三酯明顯上升(P＜0.01)，總蛋白和總膽紅素明顯降低(P＜0.05)。ATRA 10 mg·kg－1組白蛋白明顯降低，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖和甘油三酯明顯上升(P＜0.01)，總蛋白和肌酐降低(P＜0.05)，血清總膽固醇有升高(P＜0.05)。其中，ATRA對(duì)總蛋白、白蛋白、球蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和甘油三酯的影響存在一定的劑量依賴性。其他生化指標(biāo)包括電解質(zhì)指標(biāo)與溶劑對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。停藥后第15天，與溶劑對(duì)照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯上升，肌酐和葡萄糖明顯降低(P＜0.01)，但均較停藥后第1天有所恢復(fù);與溶劑對(duì)照組相比，ATRA 10和50 mg·kg－1組血清總膽固醇明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。其余各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的恢復(fù)，與溶劑對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。

Tab.3 Effect of ATRA on blood routine in rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

Tab.4 Effect of ATRA on parameters of blood biochemistry in rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

2.5 ATRA對(duì)凝血指標(biāo)的影響

如表5所示，停藥后第1天，ATRA 250 mg·kg－1組血漿凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)明顯延長(zhǎng)，凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)明顯減少(P＜0.05)。ATRA 50 mg·kg－1組 PT，INR 和活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，TT 明顯減少(P＜0.05)。ATRA 10 mg·kg－1組 PT，INR 和APTT明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)。停藥后第15天，ATRA 10，50和250 mg·kg－1組PT，TT，INR和APTT 等凝血指標(biāo)與溶劑對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。

2.6 ATRA對(duì)臟器系數(shù)的影響

如表6所示，停藥后第1天，與溶劑對(duì)照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組心、肝、脾、肺、腎和腎上腺的臟器系數(shù)明顯升高(P＜0.01)，胸腺臟器系數(shù)明顯降低(P＜0.01)。ATRA 50 mg·kg－1組肝和脾的臟器系數(shù)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。與溶劑對(duì)照組比較，ATRA 10 mg·kg－1組肝臟器系數(shù)明顯升高(P＜0.01)。停藥后第 15天，ATRA 250 mg·kg－1組心、肝、脾、肺、腎和腎上腺的臟器系數(shù)仍較溶劑對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，ATRA 10和50 mg·kg－1各臟器系數(shù)均有所恢復(fù)，與溶劑對(duì)照組無(wú)明顯差異。

Tab.5 Effect of ATRA on parameters of blood coagulation of rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

Tab.6 Effect of ATRA on organ index on 1st and 15th day after drug withdrawal

2.7 ATRA對(duì)臟器病理組織學(xué)的影響

停藥后第1天，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ATRA 50和250 mg·kg－1組大鼠出現(xiàn)肝髓外造血(圖 1C，D);ATRA 250 mg·kg－1組出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫(圖 1D);ATRA 250 mg·kg－1組出現(xiàn)十二指腸上皮細(xì)胞變性、壞死(圖2D);ATRA 10，50 和250 mg·kg－1組均出現(xiàn)脾巨核細(xì)胞增多(圖3B～D);ATRA 250 mg·kg－1組胸腺皮質(zhì)細(xì)胞減少(圖 4D);生殖系統(tǒng)組織病理改變主要表現(xiàn)為ATRA 50和250 mg·kg－1組大鼠睪丸曲精細(xì)管萎縮和生精細(xì)胞減少(圖 5C，D)，ATRA 250 mg·kg－1組附睪管腔內(nèi)精子減少并伴有間質(zhì)水腫(圖6D)。此外還發(fā)現(xiàn)骨骼出現(xiàn)纖維組織增生，類骨組織和骨小梁增生現(xiàn)象，部分大鼠毛囊減少。停藥后第15天，ATRA 10，50和250 mg·kg－1組仍存在脾巨核細(xì)胞增多，ATRA 250 mg·kg－1組5/8只大鼠睪丸出現(xiàn)中度曲精細(xì)管萎縮、生精細(xì)胞減少，2/8只大鼠出現(xiàn)毛囊減少，其他臟器整體病理改變較給藥期有所恢復(fù)(圖略)。

Fig.1 Effect of ATRA on liver histopathological changes in rats(HE).See Tab.1 for rat treatment.The rats were sacrificed on the 1st day after drug withdrawal.The yellow arrow refers to liver cells steatosis while the green arrow refers to liver cells edema and the blue arrow refers to extramedullary hematopoiesis.A:solvent control;B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.2 Effect of ATRA on duodenum histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to duodenal epithelium cells degeneration and necrosis.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg －1，respectively.

Fig.3 Effect of ATRA on spleen histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to megakaryocytes.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.4 Effect of ATRA on thymus histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to thymus cortical cells reduced.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 150 mg·kg－1，respectively.

Fig.5 Effect of ATRA on testis histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to seminiferous tubular atrophy and spermatogenic cells decreased.A:solvent control;B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.6 Effect of ATRA on epididymis histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to the reduction of sperm within the epididymis lumen while the blue arrow refers to interstitial edema.A:solvent control;B－D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1group，respectively.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，口服ATRA大鼠的紅細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)和血紅蛋白含量明顯低于正常值，并有劑量依賴性毒性反應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明ATRA能造成大鼠不同程度的血小板減少癥和貧血癥，同時(shí)存在一定的粒系增生和骨髓抑制現(xiàn)象。病理結(jié)果顯示大鼠肝和生殖系統(tǒng)有損傷。睪丸曲精細(xì)管萎縮、生精細(xì)胞減少提示ATRA可能對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有一定的毒性作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA誘導(dǎo)分化的ALP細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素1β(IL-1β)，IL-6，IL-8和腫瘤壞死因子α等血管活性細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞活化[6]。同時(shí)ATRA能夠抑制體內(nèi)IL-2基因表達(dá)和T細(xì)胞活性[7]。這些細(xì)胞因子的變化可能是發(fā)生維A酸綜合征的原因。

ATRA 250 mg·kg－1組大鼠出現(xiàn)呼吸急促可能與APL-ATRA細(xì)胞浸潤(rùn)大鼠肺組織有關(guān)。周晉等[8]用微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法體外模擬維A酸綜合征，發(fā)現(xiàn)APLATRA細(xì)胞浸潤(rùn)人肺組織的分子機(jī)制可能與CXCR4和SDF-1α的高表達(dá)有關(guān)。徐娟等[9]對(duì)APL患者的細(xì)胞黏附分子表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD11b的大量表達(dá)與維A酸綜合征有密切關(guān)系。CD11b的表達(dá)速度過(guò)于同步化，使得大量表達(dá)黏附分子白血病細(xì)胞滯留與肺循環(huán)，導(dǎo)致嚴(yán)重的通氣功能障礙。

本研究病理結(jié)果顯示，給藥組大鼠出現(xiàn)髓外造血和脾巨核細(xì)胞增多，可能是由于紅細(xì)胞數(shù)和血小板數(shù)下降機(jī)體的代償反應(yīng)，同時(shí)ATRA能夠抑制巨核細(xì)胞，造成巨核細(xì)胞成熟障礙而不能正常制造血小板，引起血小板減少。ATRA組總蛋白偏低，兩種轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、葡萄糖與甘油三酯偏高，同時(shí)出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，說(shuō)明ATRA能導(dǎo)致大鼠肝功能受損，并可能導(dǎo)致血糖升高和高甘油三酯血癥。亦有ATRA臨床致高甘油三酯血癥的報(bào)道[10]。病理研究結(jié)果顯示，纖維組織增生、類骨組織和骨小梁增生現(xiàn)象與骨折的判斷吻合。ATRA為公認(rèn)的致畸物，可以導(dǎo)致大小鼠、倉(cāng)鼠和兔等多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎畸形，機(jī)制與ATRA抑制Smad2和Smad3的磷酸化有關(guān)[11－13]。以上毒性作用與臨床所見(jiàn)個(gè)別患者的不良反應(yīng)存在一致性，可為臨床用藥不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考。更多的毒理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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