蒲韻竹，王 卓，王麗星，陳怡君，鐘玉緒，李 前，付愛(ài)玲，趙寶全

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

農(nóng)副產(chǎn)品上殘留的農(nóng)藥，具有長(zhǎng)期殘留性和生物蓄積性等特點(diǎn)[1]，其被食用后雖不會(huì)導(dǎo)致急性中毒，但也會(huì)造成人類(lèi)和動(dòng)物有機(jī)體的損傷，甚至導(dǎo)致人類(lèi)和動(dòng)物的不孕不育，或者對(duì)后代產(chǎn)生影響[2]。敵敵畏是一種高效廣譜的有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥，其生殖毒性和遺傳毒性已有一些報(bào)道。Dirican等[3]發(fā)現(xiàn)敵敵畏可導(dǎo)致雄性小鼠精囊質(zhì)量減輕，精子活力降低。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)高濃度敵敵畏對(duì)鯽魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)顯著縮短，精子軌跡為曲線(xiàn)或原地不動(dòng)。同時(shí)Farooq等[5]發(fā)現(xiàn)非致死濃度下敵敵畏可導(dǎo)致雌性鯉魚(yú)性腺指數(shù)降低。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)敵敵畏可導(dǎo)致中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞染色體的畸變。Nan等[2]研究發(fā)現(xiàn)非致死濃度下敵敵畏可導(dǎo)致泥鰍紅細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)微核。

斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因組相似度高達(dá)87%，與人類(lèi)有著相似的毒性特征和信號(hào)傳導(dǎo)通路，同時(shí)斑馬魚(yú)各器官和組織在解剖學(xué)、生理學(xué)和分子水平上已被證實(shí)與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，這意味著利用斑馬魚(yú)所得毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果在多數(shù)情況能適用于人類(lèi)[7]。斑馬魚(yú)遺傳背景清晰，對(duì)有害物質(zhì)非常敏感[8]，可用于評(píng)價(jià)化合物毒性，已被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化組織、美國(guó)環(huán)境保護(hù)局、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)，以及中國(guó)農(nóng)業(yè)部和環(huán)保部等各國(guó)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織認(rèn)定的生態(tài)毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)類(lèi)[9]，斑馬魚(yú)被稱(chēng)為是21世紀(jì)新型毒性評(píng)價(jià)模型[10]，目前已有研究者將斑馬魚(yú)用于評(píng)價(jià)納米材料的亞急性毒性[11]。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)為動(dòng)物，敵敵畏為藥物，研究斑馬魚(yú)用于評(píng)價(jià)生殖毒性和遺傳毒性可靠性，旨在建立斑馬魚(yú)亞急性條件下的生殖毒性和遺傳毒性的快速評(píng)價(jià)模型，為農(nóng)藥及環(huán)境化合物毒性評(píng)價(jià)提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

敵敵畏乳油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)77.5%，購(gòu)自天津市華宇農(nóng)藥有限公司;姬姆薩染色液(Giemsa)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)公司;碘化丙啶(propidium iodide，PI)，購(gòu)自Sigma公司;SYBR-14，購(gòu)自Invitrogen公司;Tricaine methane sulfonate(MS-222)，為北京愛(ài)普華美生物科技有限公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡:日本Olympus;AEG-120精密電子天平:日本島津;斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng):北京愛(ài)生科技有限公司。

1.2 動(dòng)物及分組給藥

AB系斑馬魚(yú)由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)馴養(yǎng)，雄雌各半，體長(zhǎng)25～35 mm。循環(huán)養(yǎng)殖水根據(jù) Brand等[12]的方法配制:每1000 L去離子水中含75 g碳酸氫鈉，18 g海鹽和8.4 g硫酸鈣，水溫(28～29)℃，pH 值7.2左右，總硬度 62 mg·L－1(以 CaCO3計(jì))，電導(dǎo)率485 μS。光照/黑暗周期為 14 h∶10 h。斑馬魚(yú)每日喂食2次人工孵化的鹵蟲(chóng)幼體。

根據(jù)敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性實(shí)驗(yàn)，其96 h LC50為19.18 mg·L－1，在此基礎(chǔ)上，設(shè)定敵敵畏 0，0.97，2.92，4.87 mg·L－1組，每組隨機(jī)選取大小相當(dāng)?shù)陌唏R魚(yú)成魚(yú)24尾(雄雌各半)，采用換水實(shí)驗(yàn)，2 L塑料盒中放6尾魚(yú)(雄雌分開(kāi))，每24 h更換一次實(shí)驗(yàn)溶液，連續(xù)染毒7和14 d。所有組斑馬魚(yú)每2 d喂食1次。

1.3 性腺指數(shù)測(cè)定

分別于敵敵畏持續(xù)染毒7 d和14 d，各濃度組隨機(jī)選取12尾斑馬魚(yú)(雄雌各半)，用0.01%的MS-222麻醉劑，麻醉約2 min后，將魚(yú)放入水中沖洗，用吸水紙吸去體表的水，電子天平稱(chēng)量其體質(zhì)量。用大頭針將麻醉后的雄魚(yú)或雌魚(yú)固定在塑料泡沫板上，在體式顯微鏡下，用解剖剪將其腹腔剪開(kāi)，用鑷將精囊或卵巢取出，放入1.5 ml離心管中稱(chēng)質(zhì)量。計(jì)算性腺指數(shù)[13]。性腺指數(shù)=性腺質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。

1.4 雄性班馬魚(yú)精子質(zhì)膜完整性檢測(cè)

精囊稱(chēng)質(zhì)量后，按照1∶20加入HBSS緩沖液〔(g·L－1)NaCl 8.0，KCl 0.4，CaCl2·2H2O 0.16，MgSO40.01，Na2HPO4·12H2O 0.15，KH2PO40.06，NaHCO30.35，C6H12O61.0，pH 7.5)中，用槍頭充分破碎精囊，待精子充分釋放后將精囊膜挑出，制成精子懸液。取 100 μl精子懸液到0.5 ml EP管中，加入 1 μl SYBR-14染料(終濃度為100 nmo·lL－1)，4℃避光培育5 min，取出再加入10 μl PI(終濃度為 12 μmol·L－1)，再 4℃避光培育5 min[14]。利用SYBR-14/PI對(duì)斑馬魚(yú)精子進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察精子質(zhì)膜完整性?；罹映示G色熒光，死精子呈紅色熒光。用10×20倍顯微鏡觀察并拍照，用Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計(jì)精子總數(shù)量及SYBR-14染色精子數(shù)量，并計(jì)算精子質(zhì)膜完整性百分比。每尾魚(yú)觀察至少3個(gè)視野。精子質(zhì)膜完整性(%)=SYBR-14染色精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.5 血細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)測(cè)定微核率

分別于敵敵畏持續(xù)染毒7和14 d后，各濃度組隨機(jī)選取8尾斑馬魚(yú)(雄雌各半)，斷尾取血，制成血涂片，涂片晾干后，甲醇固定15 min，用pH 6.8磷酸緩沖液稀釋的Giemsa液(體積比9∶1)染色10 min，pH 6.8磷酸緩沖液沖洗，晾干。血涂片置于10×100顯微鏡下觀察、照相，并用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每張涂片隨機(jī)觀察2000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算微核率(‰)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)性腺指數(shù)的影響

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，持續(xù)染毒7 d后，敵敵畏2.85 和4.65 mg·L－1組的雄性和雌性斑馬魚(yú)體質(zhì)量和雌魚(yú)性腺質(zhì)量顯降低(P＜0.01)，敵敵畏4.65 mg·L－1組雌魚(yú)性腺指數(shù)顯著降低(P＜0.01)。持續(xù)染毒14 d 后，敵敵畏0.95，2.85和4.65 mg·L－1組雄性和雌性斑馬魚(yú)體質(zhì)量和性腺質(zhì)量及雌性性腺指數(shù)均小于正常對(duì)照組(P＜0.01)，提示隨著染毒濃度的增加，雌雄兩性斑馬魚(yú)體質(zhì)量和性腺質(zhì)量顯著降低。在同一濃度下，敵敵畏0.95，2.85 和4.65 mg·L－1染毒14 d，雌魚(yú)性腺指數(shù)明顯低于染毒7 d組(P＜0.01)。提示敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)體質(zhì)量和性腺質(zhì)量有顯著影響。

Tab.1 Effect of dichlorvos on gonadosomatic index(GSI)in zebrafish

2.2 敵敵畏對(duì)雄性斑馬魚(yú)精子數(shù)量及精子質(zhì)膜完整性影響

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，持續(xù)染毒7 d，敵敵畏4.65 mg·L－1組雄性斑馬魚(yú)的精子總數(shù)顯著減少(P＜0.01)，持續(xù)染毒 14 d，敵敵畏 0.95，2.85 和 4.65 mg·L－1組精子總數(shù)顯著減少(P＜0.01)。敵敵畏2.85 和4.65 mg·L－1染毒14 d 后精子總數(shù)明顯低于同濃度染毒7 d組(P＜0.01)。

Tab.2 Effect of dichlorvos on number of sperm

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，敵敵畏2.85和4.65 mg·L－1染毒 7 d，雄性斑馬魚(yú)精子質(zhì)膜完整率顯著降低(P＜0.01);持續(xù)染毒14 d，敵敵畏0.95 mg·L－1染毒組精子質(zhì)膜完整率也顯著降低(P＜0.01)。相同染毒濃度，染毒14 d精子質(zhì)膜完整率顯著低于染毒7 d組(P＜0.01)。

Tab.3 Effect of dichlorvos on sperm membrane integrity of male zebrafish

2.3 敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)血細(xì)胞細(xì)胞核的影響

斑馬魚(yú)紅細(xì)胞除形成微核以外還形成核內(nèi)空泡、核質(zhì)外凸等異?，F(xiàn)象。敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)紅細(xì)胞微核率結(jié)果如表4所示。與正常對(duì)照組相比，敵敵畏4.65 mg·L－1持續(xù)染毒7 d，斑馬魚(yú)紅細(xì)胞微核率顯著上升(P＜0.01)，敵敵畏2.85和 4.65 mg·L－1持續(xù)染毒14 d的微核率顯著上升(P＜0.01)，而敵敵畏0.95 mg·L－1組與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示敵敵畏毒性隨著濃度的增加而變大，同樣隨著時(shí)間的增加毒性也增加。

Tab.4 Effect of dichlorvos on micronuclei rate in zebrafish

3 討論

目前國(guó)內(nèi)評(píng)價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)生殖毒性，常采用鯽魚(yú)[4]，孔雀魚(yú)[15]和金魚(yú)[16]等魚(yú)類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚(yú)雌性性腺指數(shù)及雄性精子膜完整性來(lái)評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)生殖毒性，旨在建立簡(jiǎn)單、快速評(píng)價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥生殖毒性的可能性。由于雄魚(yú)用于配子產(chǎn)生的能量少于雌魚(yú)[17]，所以常用性腺指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)雌魚(yú)的性腺發(fā)育與毒性情況[18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，敵敵畏染毒后14 d雌魚(yú)性腺指數(shù)顯著降低。Farooq等觀察11月份到次年4月份期間敵敵畏非致死濃度下對(duì)雌性鯉魚(yú)卵巢指數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)隨觀察月份的增加，卵巢指數(shù)不斷增加，4月份的卵巢指數(shù)是11月份的3倍，說(shuō)明鯉魚(yú)的性腺指數(shù)不僅與給藥濃度有關(guān)還與實(shí)驗(yàn)時(shí)間有關(guān)。而斑馬魚(yú)可全年產(chǎn)卵，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可不受實(shí)驗(yàn)時(shí)間影響。雄性生殖精子膜完整性是精子活動(dòng)力、精子新陳代謝的基礎(chǔ)，也是完成與受精過(guò)程有關(guān)活動(dòng)的基礎(chǔ)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敵敵畏能降低雄魚(yú)精子數(shù)量，且死亡精子增多;隨著濃度及時(shí)間的增加，敵敵畏能顯著降低雄魚(yú)精子質(zhì)量，這與Dirican等[3]用小鼠得到敵敵畏影響雄性精子質(zhì)量結(jié)果一致。Zhang等[4]利用鯽魚(yú)精子評(píng)價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥的生殖毒性，但鯽魚(yú)精子體外直接接觸有機(jī)磷農(nóng)藥的給藥方式無(wú)法模擬現(xiàn)實(shí)情況下染毒方式及作用結(jié)果。與鯽魚(yú)相比，采用斑馬魚(yú)成本低，個(gè)體小，飼養(yǎng)空間小，同時(shí)采用精子質(zhì)膜完整性來(lái)評(píng)價(jià)精子質(zhì)量，可以在不激活精子的情況下，通過(guò)熒光顯微鏡、熒光染料及圖像分析軟件，便能簡(jiǎn)單、快捷的評(píng)價(jià)化合物對(duì)雄性斑馬魚(yú)的生殖毒性。

魚(yú)類(lèi)血細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)是一種有效的體內(nèi)遺傳毒性檢測(cè)方式，可用于在線(xiàn)監(jiān)測(cè)水質(zhì)及環(huán)境毒物評(píng)價(jià)[20]。微核形成可用于的檢測(cè)染色體異常，是遺傳毒性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)[21]。常用的魚(yú)類(lèi)有鯉魚(yú)[22]，鯽魚(yú)[23]，泥鰍[2]和黃鱔[24]等。本實(shí)驗(yàn)選擇斑馬魚(yú)一方面由于其遺傳背景清楚，對(duì)于進(jìn)一步機(jī)制研究有一定優(yōu)勢(shì)，另一方面斑馬魚(yú)的血紅細(xì)胞體積較大，經(jīng)吉姆薩染色后，其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核在顯微鏡下結(jié)構(gòu)清晰，易于觀察微核。正常斑馬魚(yú)血細(xì)胞多呈橢圓形，其主核位于細(xì)胞正中間，主核多數(shù)呈卵圓形，少數(shù)呈圓形。斑馬魚(yú)在敵敵畏處理后，其造血系統(tǒng)的干細(xì)胞發(fā)生顯著的變化，細(xì)胞染色體發(fā)生斷裂而產(chǎn)生的斷片或殘留的染色體在胞漿內(nèi)形成微核，斑馬魚(yú)紅細(xì)胞因敵敵畏的誘發(fā)出現(xiàn)的核變異中，主要包含了微核和核異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨敵敵畏作用時(shí)間和濃度的增加，斑馬魚(yú)微核率顯著上升。Nan等用敵敵畏6.409 g·L－1染毒泥鰍9 d的微核率為 2.138‰，本實(shí)驗(yàn)用敵敵畏4.65 mg·L－1染毒斑馬魚(yú)7 d，微核率為8.7‰，并且染毒14 d后微核率升高3倍。雖然泥鰍對(duì)敵敵畏敏感，染毒劑量低，但是微核形成率沒(méi)有斑馬魚(yú)高，同時(shí)斑馬魚(yú)取材方便，剪尾取血后不會(huì)死亡，魚(yú)尾可在幾天內(nèi)重新長(zhǎng)出，這對(duì)于長(zhǎng)期研究及監(jiān)測(cè)毒物的遺傳毒性研究了提供便利條件。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)生殖和遺傳毒性的作用表現(xiàn)，說(shuō)明斑馬魚(yú)具有做為研究藥物及毒物的遺傳及生殖毒性作用模型的可能。

[1]Jones KC，de Voogt P.Persistent organic pollutants(POPs):state of the science[J].Environ Pollut，1999，100(1-3):209-221.

[2]Nan P，Xiao Z，Chen JJ，Chang ZJ.Genetics toxicity and physiology toxicity of dichlorovos to Misgurnus anguillicaudatus[J].J Henan Normal Univ(Nat Sci Ed)〔河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)〕，2011，39(5):137-140.

[3]Dirican EK，Kalender Y.Dichlorvos-induced testicular toxicity in male rats and the protective role of vitamins C and E[J].Exp Toxicol Pathol，2012，64(7-8):821-830.

[4]Zhang YB，Hu JH，Li M，Zhou RR，Sun JZ.The sperm motility of Carassius auratus affected by organophosphorus pesticides，dichlorovos[J].J Liaocheng Univ(Nat Sci Ed)〔聊城大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)〕，2008，21(3):79-82.

[5]Farooq AM，Ghulam MS，Ulfat J，Javaid IM.Studies on influences of sublethal concentrations of organophosphate pesticide;dichlorvos(DDVP)on gonadosomatic index(GSI)of female common carp，Cyprinus carpio communis[J].Am-Euras J Toxicol Sci，2012，4(2):67-71.

[6]Wang TC，Lin CM，Lo LW.Genotoxicity of methoxyphosphinyl insecticide in mammalian cells[J].Zool Studies，2003，42(3):462-469.

[7]Wang JJ，Xu C，Tu YJ，F(xiàn)u ZW，Liu WP.Experimental research and application of zebrafish and embryos in toxicology[J].Asian J Ecotoxicol(生態(tài)毒理學(xué)報(bào))，2007，2(2):123-135.

[8]Parng C.In vivo zebrafish assays for toxicity testing[J].Curr Opin Drug Discov Dev，2005，8(1):100-106.

[9]Hill AJ，Teraoka H，Heideman W，Peterson RE.Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity[J].Toxicol Sci，2005，86(1):6-19.

[10]Sipes NS，Padilla S，Knudsen TB.Zebrafish:as an integrative model for twenty-first century toxicity testing[J].Birth Defects Res C Embryo Today，2011，93(3):256-267.

[11]Ramsden CS，Henry TB，Handy RD.Sub-lethal effects of titanium dioxide nanoparticles on the physiology and reproduction of zebrafish[J].Aquat Toxicol，2013，126:404-413.

[12]Brand M，Granato M，Nüsslein-Volhard C.Keeping and Raising Zebrafish[M].Oxford:Oxford University Press，2002:7-37.

[13]Kingdom T， Allison ME. The Fecundity，gonadosomatic and hepatosomatic indicies of pellonula leonensis in the Lower Nun River，Niger Delta，Nigeria[J].Curr Res J Biol Sci，2011，3(2):175-179.

[14]Klimowicz-Bodys MD，Batkowski F，Ochrem AS，Saviˇc MA.Comparison of assessment of pigeon sperm viability by contrast-phase microscope(eosin-nigrosin staining)and flow cytometry〔SYBR-14/propidium iodide(PI)staining〕〔evaluation of pigeon sperm viability〕[J].Theriogenology，2012，77(3):628-635.

[15]Shi QY，Ru SG，Bing X.Effect of the toxicity of monocrotophos on reproductive power of the male guppy，Poecilia reticulate[J].J Safety Environ(安全與環(huán)境學(xué)報(bào))，2007，7(3):4-9.

[16]Fang Y. The reproduction toxicity of monocrotophos on male goldfish，Carassiues auratus(久效磷對(duì)雄性金魚(yú)的生殖毒性研究)[D].Qingdao:Ocean University of China，2007:1-2.

[17]Rheman S，Islam ML，Shah MMR，Mondal S，Alam MJ.Observation on the fecundity and gonadosomatic index(GSI)of gray mullet Liza parisa(Ham.)[J].Bio Sci，2002，2(10):690-693.

[18]Patimar R.Rahman Patimar1.Some biological aspects of the sharpnose mullet Liza saliens(Risso，1810)in Gorgan Bay-Miankaleh Wildlife Refuge(the Southeast Caspian Sea).[J].Turk J Fish Aquat Sci，2008，8:225-232.

[19]Grossfeld R，Sieg B，Struckmann C，F(xiàn)renzel A，Maxwell WM，Rath D.New aspects of boar semen freezing strategies[J].Theriogenology，2008，70(8):1225-1233.

[20]al-Sabti K， Metcalfe CD. Fish micronuclei for assessing genotoxicity in water[J].Mutat Res，1995，343(2-3):121-135.

[21]Liu LB，Wang LL.Application progress of high content analysis in discovery toxicology[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2012，26(6):893-896.

[22]Klobucar GI，Stambuk A，Pavlica M，Serti＇c Peri＇c M，Kutuzovi＇c Hackenberger B，Hylland K.Genotoxicity monitoring of freshwater environments using caged carp(Cyprinus carpio)[J].Ecotoxicology，2010，19(1):77-84.

[23]Cavas T. In vivo genotoxicity evaluation of atrazine and atrazine-based herbicide on fish Carassius auratus using the micronucleus test and the comet assay[J].Food Chem Toxicol，2011，49(6):1431-1435.

[24]Zhang Y，Wang YK.Infection of cadmium to liver and micronucleus rate of red blood cell in mud eel[J].J Shaanxi Univ Technol(Nat Sci Ed)〔陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)〕，2008，24(3):87-90.