韓春光，黃火高，王 瓊，高志清，彭明麗，承京霞，劉永學

(1.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所藥理學與毒理學研究室，北京 100850;2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院干部保健科，北京 100037)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進行性的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎和對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鳌＝陙?，免疫分子在RA發(fā)病中的作用越來越受到人們重視。抗原提呈細胞通過T細胞受體(T cell receptors，TCR)與T細胞識別，后者在B7共刺激因子的作用下被活化，活化的T細胞再激活巨噬細胞，由巨噬細胞產(chǎn)生多種炎性細胞因子，這些炎性細胞因子進一步作用于巨噬細胞、成纖維細胞、T細胞和成骨細胞，通過細胞基質(zhì)金屬蛋白酶和NF-κB受體激活物的配基等導(dǎo)致軟骨和骨破壞[1]。由此提示，TCR抗體對RA可能具有一定的治療作用。本研究制備DBA/1小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型，觀察鼠源 TCR(mouse TCR，mTCR)單抗對RA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

DBA/1小鼠，體質(zhì)量20～24 g，18周齡，雄性，購自上海藥物研究所，SPF級飼養(yǎng)，動物合格證號:中科動管會第001號。地塞米松磷酸鈉注射液，天津金耀氨基酸有限公司;mTCR單抗，美國Gene Tex公司。牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑，美國Chondrex公司。Luminex200型多功能流式液相芯片分析儀，美國Millipore公司。

1.2 動物分組、模型制備和給藥

將DBA/1小鼠隨機分為正常對照、模型、地塞米松0.5 mg·kg－1和 mTCR 單抗25 mg·kg－1治療組，每組6只。CIA小鼠模型的制備按照文獻[2]進行。除正常對照組外，將牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑充分混合，制成膠原乳劑，含Ⅱ型膠原2 g·L－1，每只小鼠尾根部皮內(nèi)1次注射100 μl，將注射當日記為第1天，于第21天加強誘導(dǎo)1次。地塞米松治療組于第29～41天皮下注射地塞米松磷酸鈉注射液，隔日一次;mTCR單抗治療組分別于第0和第21天皮下注射給藥1次;正常對照和模型對照組皮下注射等體積生理鹽水。

1.3 體質(zhì)量和足掌厚度測量、關(guān)節(jié)炎評分及CIA發(fā)生率計算

以電子天平動態(tài)稱量小鼠體質(zhì)量，每周2次。以游標卡尺測量小鼠足掌厚度。關(guān)節(jié)炎炎癥指數(shù)評分標準:0分，關(guān)節(jié)正常;1分，關(guān)節(jié)輕微紅腫;2分，關(guān)節(jié)紅腫嚴重，累及整個關(guān)節(jié);3分，足爪或關(guān)節(jié)功能障礙，關(guān)節(jié)僵硬。每只小鼠的關(guān)節(jié)炎癥的總評分為四肢評分的總和，每只小鼠的最高分值為12分，關(guān)節(jié)總評分大于1的小鼠為建模成功小鼠[3]。

1.4 踝關(guān)節(jié)組織病理變化觀察

連續(xù)觀察到給藥后第60天實驗結(jié)束，處死小鼠，取踝關(guān)節(jié)進行組織切片，HE染色，鏡下觀察組織病理改變，包括關(guān)節(jié)組織炎癥細胞浸潤和骨骼破壞。

1.5 血清細胞因子測定

連續(xù)觀察到給藥后第60天實驗結(jié)束，取血清，通過Luminex200液晶芯片分析平臺，測定小鼠血清 γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素 4(interleukin-4，IL-4)的含量。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 mTCR單抗對CIA模型小鼠體質(zhì)量和足腫脹度的影響

實驗過程中，各組小鼠體質(zhì)量無明顯變化。CIA發(fā)生發(fā)展過程中，小鼠的受累關(guān)節(jié)首先表現(xiàn)為腫脹，足掌厚度明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，第31～59天，地塞米松和mTCR單抗治療組足掌厚度明顯降低(P＜0.01)(圖1)。

Fig.1 Effect of mouse monoclonal antibody of T cell receptors(mTCR mAb)on thickness of foot palm of collagen typeⅡinduced arthritis(CIA)model mice.On the 1st and 22nd day，bovine typeⅡcollagen and complete Freund adjuvant emulsion was injected intradermally in order to prepare the CIA mouse model.From the 29th to 41st day，dexamethasone sodium phosphate injection 0.5 mg·kg －1was sc given to the mice of dexamethasone treatment group every other day.The mice of mTCR mAb group were sc injected mTCR mAb 25 mg·kg －1on the 0(before model preparation)and 21st day，respectively.After administration for 60 d，the thickness of foot palm was mearsured.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 mTCR單抗對CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

如圖2所示，自第28天發(fā)病開始，CIA模型組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸增加(P＜0.01)。與模型組比較，地塞米松和mTCR單抗治療組小鼠的炎癥指數(shù)明顯減小(P＜0.05，P＜0.01)。

Fig.2 Effect of mTCR mAb on joint inflammatory index in CIA model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 mTCR單抗對CIA模型小鼠CIA發(fā)生率的影響

從第29天開始，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫和關(guān)節(jié)活動受限等典型的CIA病變。第42天，模型組CIA發(fā)生率已達6/6，地塞米松和mTCR單抗治療組分別為2/6和1/6;第49天，模型組和地塞米松治療組CIA發(fā)生率維持不變，mTCR單抗治療組升高為5/6(表1)。

Tab.1 Effect of mTCR mAb on incidence of CIA in DBA/1 mice

2.4 mTCR單抗對CIA模型小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響

與正常組(圖3A)相比，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)表現(xiàn)為大量炎癥細胞浸潤，骨侵蝕明顯(圖3B);與模型組比較，地塞米松和mTCR單抗治療組小鼠僅有少量炎癥細胞浸潤，而且骨侵蝕不明顯(圖3C，D)。

Fig.3 Effect of mTCR mAb on pathological changes of ankle joints in CIA model mice(200 ×).See Fig.1 for the mouse treatment.A:normal control;B:model;C:dexamethasone;D:mTCR mAb.?:bony erosion;↑:inflammatory cells infiltrate.

2.5 mTCR單抗對 CIA模型小鼠血清 IFN-γ，IL-4和TNF-α含量的影響

表2結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清IL-4含量明顯降低(P＜0.05)，TNF-α 含量明顯增加(P＜0.01);與模型組相比，地塞米松和mTCR單抗治療組小鼠IL-4含量顯著增加(P＜0.05)，TNF-α明顯降低(P＜0.05);各組小鼠血清 IFN-γ含量無明顯變化。

Tab.2 Effect of mTCR mAb on serum concentration of interferon-γ(IFN-γ)，interleukin-4(IL-4)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in CIA model mice

3 討論

RA是一種常見的自身免疫性疾病。T細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)紊亂是其發(fā)病機制之一。據(jù)報道，RA受累關(guān)節(jié)局部T細胞數(shù)量明顯增加，而且病變程度與T細胞聚集程度密切相關(guān)[4]，提示T細胞及其有關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)參與了RA的發(fā)生發(fā)展過程。因此，免疫反應(yīng)與炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子等各自作用和相互關(guān)系已成為目前治療RA研究的重要內(nèi)容之一[5]。

RA涉及的細胞免疫反應(yīng)主要與某些特定的T細胞亞群有關(guān)。TCR是成熟T細胞的特征性標志，與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)形成HLA-抗原-TCR復(fù)合物，并激活T細胞，是T細胞表面特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，也是TCR單抗有望成為RA防治藥物的理論基礎(chǔ)[6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mTCR單抗可以降低CIA的發(fā)生率，明顯減輕足掌腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)，明顯降低炎癥細胞浸潤和骨破壞。由此提示，mTCR單抗對CIA具有一定的治療作用，也進一步證實T細胞參與RA的發(fā)病過程。但自給藥后第45天開始，mTCR單抗治療組足掌厚度和炎癥指數(shù)有所升高;第49天以后CIA發(fā)生率升高，接近模型組;上述結(jié)果提示本研究mTCR單抗的給藥方案需進一步改進，如增加給藥次數(shù)等。

RA發(fā)病過程中 T輔助細胞1(T helper 1，Th1)和Th2平衡失調(diào)[7]，它們主要通過分泌不同的細胞因子影響RA的發(fā)展過程。Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ，IL-2和TNF-α等，參與細胞免疫反應(yīng);Th2細胞產(chǎn)生IL-4和IL-10等，參與體液免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠血清TNF-α水平顯著高于正常對照組，IL-4水平低于正常對照組;與模型組相比，地塞米松和mTCR單抗治療組血清TNF-α含量明顯降低，IL-4含量明顯升高，提示CIA模型小鼠Th1/Th2平衡失調(diào)，地塞米松和mTCR單抗均可恢復(fù)其平衡，mTCR單抗對CIA的治療作用可能與調(diào)節(jié)細胞因子水平、恢復(fù)Th1/Th2平衡有關(guān)。

[1]Xi ZD， Zhang DQ， Zhang YY， Zang JW.Research advances on collagen-induced arthritis in mice[J].Nat Mag(自然雜志)，2003，25(1):46-41.

[2]Cheng JX，Han CG，Wang Q，Xu JP，Liu YX.Characterization of collagen induced arthritis in DBA/1 mice[J].Pharm J Chin PLA(解放軍藥學學報)，2007，23(2):94-96.

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