李紅玉，房有榮，于海濤，俞盈，閻輝

浙江省醫(yī)學科學院藥物研究所，浙江 杭州 310013

核酸轉染哺乳動物細胞通常使用商業(yè)的陽離子脂質體試劑，然而，這些試劑的轉染效率因細胞種類的不同差別很大。許多細胞株包括一些神經(jīng)細胞、T細胞、成纖維細胞和上皮細胞等已證明抵抗一般的陽離子脂質體轉染試劑[1-4]。另一些轉染細胞的方法如電穿孔法[5]和病毒介導法[6-7]具有一定的細胞毒性或以未知方式擾亂細胞功能等缺點。近來出現(xiàn)的核酸轉染新方法，包括lipidoids[8]、陽離子聚合物[9]、無機納米粒子[10]、碳納米管[11]、細胞穿透肽[12-13]、陽離子蛋白-抗體融合[14-15]、化學修飾的核酸[16]等，在針對特定種類細胞時，分別具有一定的優(yōu)勢。然而，通常這些方法準備過程較復雜，且在各細胞株中轉染效率差別較大。

David R. Liu實驗室通過研究綠色熒光蛋白(GFP)的分子表面結構，在不影響蛋白熒光特性的前提下，把非保守氨基酸替換成一些帶正電荷或負電荷的氨基酸，得到一些“超電荷蛋白”[17]。這樣的超電荷蛋白不僅保持原有的性能，而且獲得了一些不同尋常的特性[18]。表面帶有36個正電荷的綠色熒光蛋白 (+36GFP)由于靜電排斥作用，使蛋白溶液具有更高的穩(wěn)定性。+36GFP可以通過靜電作用與DNA或RNA結合，形成單分散顆粒，用這種結合物轉染細胞可以高效地將核酸攜帶進細胞[18]。諸多報道證明，很多帶正電的多肽和蛋白都具有細胞穿透作用，例如衍生于艾滋病毒的tat細胞穿透肽[19-25]。+36GFP的轉染效率是tat細胞穿透肽的100倍，對于一些耐受陽離子脂質體的細胞株也可以成功轉染，而且無明顯的細胞毒性[26]。因+36GFP保留了固有的綠色熒光特性，使整個實驗操作可以肉眼觀察，簡化了操作過程。

改造得到的+36GFP所具有的這些特性，為尋找更理想的轉染方法提供了新思路。這就為外源核酸進入細胞內發(fā)揮作用開辟了一條便捷之路，無論對科學研究還是對核酸藥物的實際應用都具有非常重要的意義。本實驗將初步研究+36GFP的這些特性，為以后進一步的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pET+36GFP-HA2原核系統(tǒng)表達融合蛋白+36GFP-HA2，其中HA2為一段具有破囊泡作用的短肽，+36GFP蛋白N端具有His-tag標簽，該質粒由哈佛大學的David R. Liu博士惠贈；質粒LeGO-1×T/BSD具有真核啟動子，可在細胞中表達紅熒光蛋白，由德國漢堡大學 Boris Fehse教授惠贈[27-28]；感受態(tài)菌株 E.coli BL21(DE3)購自 Novagen公司；Ni-NTA Agarose購自QIAGEN公司；1 mL HiTrap Q FF離子層析柱、5 mL HiTrap Desalting脫鹽柱購自GE公司；蛋白質分子量 Marker購自北京全式金公司和Fermentas公司；ECL顯色液、FITC熒光標記試劑盒購自Pierce Biotechnology公司；牛血清白蛋白 (BSA)、LB培養(yǎng)基購自上海生工生物工程公司；DMEM、RPMI-1640、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)和 Lipofectamine 2000轉染試劑均購自 Invitrogen公司；青霉素/鏈霉素雙抗(10 000 IU/mL)購自天津灝洋生物；鼠抗His-tag一抗抗體購自天根公司、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體均購于武漢博士德公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍G-250染色液、脫色液購自碧云天公司。

1.2 主要儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 (Sanyo，日本)，蛋白電泳系統(tǒng) (Bio-Rad，美國)，熒光倒置顯微鏡(Leica,德國)，流式細胞儀 (BD，美國)，高速冷凍離心機 (Beckman，美國)，激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國)、凝膠成像儀 (Bio-Rad，美國)。

1.3 +36GFP蛋白的表達純化

質粒pET+36GFP-HA2轉化化學感受態(tài)表達菌株E. coli BL21(DE3)，平板上挑取單克隆菌落，篩選高表達菌株。利用自動誘導培養(yǎng)基[29-30]表達目的蛋白，離心沉淀菌體，在非變性條件下裂解菌體。取上清按照 QIAGEN 公司 QIA expressionistTM蛋白純化系統(tǒng)關于His-tag標簽蛋白的純化說明書操作[26]。將通過親和層析得到的蛋白，先通過1 mL HiTrap Q FF離子層析柱進行離子交換，然后再通過5 mL HiTrap Desalting脫鹽柱，用含10%甘油的PBS洗脫，過濾除菌。BCA法測定蛋白的濃度用于后續(xù)的實驗。

1.4 +36GFP蛋白的細胞轉導實驗

B16細胞、293細胞、HepG2細胞用含有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗 (100 IU/mL)的 DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，A549細胞用含有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗 (100 IU/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將處于指數(shù)生長期的4種細胞分別傳代于 24孔板，待細胞匯合度達90%時，用+36GFP蛋白進行轉導。其中293細胞中+36GFP 的終濃度為 25、50、100、200 nmol/L；HepG2細胞中+36GFP的終濃度為25、50、100、200 nmol/L；A549細胞中+36GFP的終濃度為12.5、25、50、100 nmol/L；A549細胞中+36GFP的終濃度為12.5 nmol/L、25 nmol/L和50 nmol/L，同時設空白對照。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min后吸去培養(yǎng)液，用無鈣鎂溶液洗滌 1次，0.25%胰蛋白酶消化，用含20 U/mL肝素的PBS洗滌3次，重懸，流式細胞儀 FITC通道檢測熒光細胞百分比。

接種A549細胞至2個NEST-35mm細胞培養(yǎng)皿中 (其玻底直徑為 2 cm)，待細胞融合度達到80%時，在其中1個平皿中加入+36GFP蛋白使其終濃度為100 nmol/L，另1個平皿不做處理，37 ℃孵育4 h后用含20 U/mL肝素的PBS洗滌3次，激光共聚焦觀察+36GFP蛋白的轉導效果。

1.5 +36GFP凝膠阻滯實驗

用濃度為0.9 μg/μL的+36GFP蛋白和濃度為0.4 μg/μL 的質粒 LeGo-1×T/BSD 分別按 4∶1、9∶1、14∶1、19∶1和24∶1的體積比例混合。20 ℃振蕩混勻30 min后，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀察結果。

1.6 +36GFP蛋白結合質粒 LeGO-1×T/BSD轉染HepG2細胞

接種HepG2細胞到4個NEST-35mm細胞培養(yǎng)皿中 (其玻底直徑為 2 cm)，次日細胞融合度達到80%時用于轉染實驗。其中1培養(yǎng)皿用脂質體 Lipofectamine2000轉染質粒 LeGO-1×T/BSD(0.4 μg/μL)：分別用 100 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基稀釋 2 μg 質 粒 LeGO-1×T/BSD 和 5 μL Lipofectamine2000，室溫孵育5 min后混合，繼續(xù)孵育 20 min，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基用OPTI-MEM培養(yǎng)基洗滌細胞2次，將200 μL混合物加入平皿并再補加200 μL OPTI-MEM；另外3 個培養(yǎng)皿分別用 20 μL、50 μL、100 μL 的+36GFP蛋白結合2 μg質粒LeGO-1×T/BSD轉染HepG2細胞：2 μg質粒LeGO-1×T/BSD分別與20 μL、50 μL、100 μL +36GFP 蛋白混合 20 ℃振蕩混勻 30 min后加入平皿中，每個平皿用OPTI-MEM培養(yǎng)液補足至400 μL；最后1個培養(yǎng)皿中只加入2 μg質粒LeGO-1×T/BSD，同樣用OPTI-MEM 培養(yǎng)液補足至 400 μL。所有平皿放入37 CO℃2孵箱里培養(yǎng)6 h，然后換液加入含有10% FBS無抗生素的 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。激光共聚焦觀察細胞中質粒 LeGO-1×T/BSD的表達。

1.7 +36GFP蛋白攜帶質粒 LeGO-1×T/BSD轉染293細胞

293細胞接種到12孔板中，待細胞融合度達到90%時用于轉染實驗?？瞻捉M為完全不做處理的細胞；實驗對照組只加入4 μL質粒LeGO-1×T/BSD (0.4 μg/μL)；脂質體轉染組將 4 μL 質粒和4 μL Lipofectamine2000 分 別 加 入 100 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，混合繼續(xù)孵育20 min，將200 μL混合物加入平板中；實驗組共有 4組，+36GFP 蛋白 (0.9 μg/μL)和質粒分別按照25∶1、50∶1、100∶1和200∶1的體積比混合，20 ℃振蕩混勻30 min后，加入培養(yǎng)孔中用 OPTI-MEM 培養(yǎng)基補足終體積為200 μL。平板放入37 CO℃2孵箱里培養(yǎng)6 h，然后換液加入含有 10% FBS無抗生素的 DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，0.25%胰蛋白酶消化，用含20 U/mL肝素的PBS洗滌3次，重懸，流式細胞儀FL2通道檢測。

2 結果

2.1 +36GFP蛋白誘導表達的Western blotting驗證

自動誘導培養(yǎng)基 30 ℃過夜培養(yǎng)含 pET+36GFP-HA2質粒的BL21(DE3)表達菌株，離心收集細菌沉淀，在紫外線下觀察，與空白的BL21(DE3)菌株沉淀相比，具有很強的熒光 (未顯示)；Western blotting檢測得到特異性的條帶(圖 1)。

2.2 +36GFP蛋白的表達純化

大規(guī)模培養(yǎng)后，菌體沉淀裂解離心后，可直接觀察到上清呈現(xiàn)綠色，提示目的蛋白在菌體內主要以可溶型而非包涵體形式存在。將此上清通過Ni-NTA柱子，可清楚地觀察到蛋白與柱子結合，洗脫后洗脫液呈綠色。將親和層析各步驟的樣品進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，脫色后發(fā)現(xiàn)+36GFP蛋白的純度隨著洗脫次數(shù)的增加純度提高，最后一次洗脫幾乎無其他雜帶 (圖 2)。

圖1 +36GFP蛋白表達的Western blotting驗證Fig. 1 Identification of the expressed +36GFP protein in E. coli by Western blotting. C: blank, bacterial with no plasmids; 1?4: bacterial colonies containing vector pET+36GFP–HA2, the primary antibody was mouse anti-His antibody and secondary antibody was goat anti-mouse IgG-HRP, and the positive band was visible at about 31 kDa; M: protein marker.

2.3 細胞轉導實驗

流式細胞儀分析顯示，在293細胞、HepG2細胞、A549細胞和B16細胞中，低濃度的+36GFP蛋白即具有很高的轉導效率，且隨著濃度升高轉導效率增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，當濃度達到一定值時轉導效率趨于穩(wěn)定 (圖3)。其穿透率的具體百分比在表1中列出。與對照組比較，激光共聚焦觀察到+36GFP蛋白對 A549細胞的轉導效果非常顯著 (圖4)。

2.4 凝膠阻滯實驗

凝膠阻滯分析顯示，+36GFP能夠與帶負電的質粒DNA結合，阻滯DNA在凝膠中遷移。圖中明顯觀察到，隨著+36GFP體積比例增加，蛋白對質粒的阻滯作用越來越大，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，最后DNA被完全地阻滯在了上樣孔中 (圖 5)。

圖2 +36GFP蛋白通過His-tag親和純化各階段樣品的SDS-PAGE電泳Fig. 2 SDS-PAGE analysis of various stages samples from His-tag affinity chromatography of +36GFP protein. 1: the first washing; 2: the second washing; 3:the first elution; 4: the second elution; 5: the third elution; M: protein marker.

表1 +36GFP對各類細胞轉導效率的流式細胞儀檢測Table 1 Transduction efficiency of +36GFP protein to various cells tested by flow cytometry

圖3 +36GFP對各類細胞轉導效率的流式細胞儀檢測Fig. 3 Transduction efficiency of +36GFP protein to various cells assayed by flow cytometry. (A?D)The +36GFP protein was used to transduce a variety of mammalian cell lines including 293 cells, HepG2 cells, A549 cells and B16 cells at specified protein concentrations respectively. FACS analysis was performed on a BD Flow cytometry at 25 °C.

圖4 +36GFP蛋白對A549細胞轉導效率的激光共聚焦檢測Fig. 4 Transduction efficiency of +36GFP protein to A549 cells observed under laser scanning confocal microscope.(A?C) The internalization of +36GFP in A549 cells after co-incubation for 4 h at 37 °C. (A) The image of UV. (B) The image of visible light. (C)The image is an overlay of two channels: white (visible light)and UV. (D?F)Control.

圖5 +36GFP蛋白包裹質粒DNA的凝膠阻滯實驗Fig. 5 Gel-shift assay of plasmid DNA packaged by+36GFP protein. M: DNA marker; 1?5: the volume ratio of +36GFP protein and plasmid DNA was 4:1, 9:1, 14:1,19:1 and 24:1, respectively.

2.5 HepG2細胞轉染實驗

激光共聚焦觀察質粒 LeGO-1×T/BSD 的表達情況。該質粒經(jīng) Lipofectamine2000攜帶入細胞后，在 HepG2細胞中表達強度較高，在波長為540 nm的綠光下可觀察到細胞中紅熒光較強。20 μL、50 μL、100 μL 的+36GFP 蛋白也可攜帶質粒進入細胞，報告基因也可以表達，但是蛋白的表達量要低于脂質體轉染組 (圖6)。這可能是因為蛋白攜帶質粒進入細胞后要經(jīng)歷囊泡包裹、蛋白降解、質粒釋放等步驟，這就使質粒表達紅熒光的時間要晚于脂質體。至于+36GFP攜帶質粒轉導細胞后蛋白何時表達量最高，是否呈現(xiàn)濃度依賴性，我們將進一步利用流式細胞儀技術證明。

圖6 +36GFP蛋白對HepG2細胞轉染效率的激光共聚焦檢測Fig. 6 Transfection efficiency of +36GFP protein to HepG2 cells observed under laser scanning confocal microscope.(A) 5 μL Lipofectamine2000 transfection reagent transfected 2 μg plasmid LeGO-1×T/BSD (0.4 μg/μL) into HepG2 cells. (A1) The image is an overlay of two channels: white (visible light) and red (540 nm light). (A2) The image of 540 nm light. (A3) The image of visible light. (B?D) 20 μL, 50 μL and 100 μL +36GFP protein (0.9 μg/μL) with 2 μg plasmid LeGO-1×T/BSD (0.4 μg/μL). (B1, C1, D1) The overlay of two channels: white (visible light) and red (540 nm light). (B2, C2, D2)The image of 540 nm light. (B3, C3, D3)The image of visible light. (E)Control, only 2 μg plasmid,no Lipofectamine2000 and no +36GFP protein.

2.6 轉染效率的流式細胞儀檢測

流式細胞儀FL2-H通道檢測293細胞中報告基因的表達情況。凝膠阻滯實驗中，我們得出結論當?shù)鞍着c質粒的體積比大于24∶1，+36GFP蛋白可完全結合質粒LeGO-1×T/BSD阻滯其在凝膠中的遷移。因而此實驗中我們設計了4組實驗，蛋白與質粒的體積比依次是25∶1、50∶1、100∶1和200∶1，流式檢測結果顯示紅熒光蛋白的表達量隨著體積比的增大而增高 (圖 7A)。相比較于HepG2細胞轉染實驗，該實驗中轉染時間從 24 h延長至48 h，梯度拉大，流式細胞儀統(tǒng)一計數(shù)10 000個細胞中有紅熒光表達的細胞所占的百分比，隨著體積比增大百分比依次為 55.22%、73.58%、85.46%和89.24% (圖7B)，呈現(xiàn)劑量效應關系。

圖7 +36GFP蛋白對293細胞轉染效率的流式細胞檢測Fig. 7 Transfection efficiency of +36GFP protein to 293 cells tested by flow cytometry. (A)Flow cytometry analysis showing amounts of expressed red fluorescent protein in 293 cells treated with various ratio of +36GFP vs plasmid DNA and washed three times with PBS containing heparin to remove cell surface-bound GFP. (B)Histogram of the expressed red fluorescent protein.

3 討論

1990年 Wolff等發(fā)現(xiàn)，將表達報道基因的質粒直接注入骨骼肌后能檢測到報道基因的表達[31]，但直接注射裸露的DNA或質粒DNA進入細胞，DNA的表達效率很低；與直接注射裸DNA相比，采用電穿孔法可使DNA的表達效率高1 000倍[32]，但對細胞損害較大；微粒轟擊法，即“基因槍”，對目的DNA沒有要求，可大可小，也可以是RNA、蛋白質、化學藥物等多種物質，且無明顯的致細胞變性反應，但其對實驗條件的要求相對較高[33]。目前實驗室應用最廣泛的是陽離子脂質體轉染。外源DNA與脂質體結合，形成載體-DNA復合物，利用這種復合物將外源DNA導入靶細胞，最終使外源基因在靶細胞中獲得表達，但陽離子脂質體對細胞具有一定的毒性且轉染效率因細胞不同而有所差異。

本研究成功表達并純化了+36GFP蛋白，并證實+36GFP確有很強的細胞穿透性，而且細胞種類差異性很小。+36GFP穿透細胞膜的機理，國外許多科研人員已經(jīng)進行了相應的研究[34]。+36GFP蛋白自身帶有36個靜電荷，相互存在很強的靜電排斥作用而不容易聚沉，蛋白溶液更為穩(wěn)定，不僅方便了整個蛋白表達純化的操作過程，而且有利于蛋白保存、蛋白功能研究及進一步的開發(fā)應用。根據(jù)脂質體轉染原理，帶正電的脂質體顆?？梢园鼛ж撾姷馁|粒分子，然后將其攜帶入細胞。+36GFP表面帶有36個正電荷，同樣可以與帶負電的核酸分子結合，充當一種轉染試劑。本研究中，我們首先進行了凝膠阻滯實驗，驗證了當?shù)鞍缀唾|粒DNA相互間達到一定的比例時，蛋白會完全將DNA包裹住，阻滯其在凝膠中的遷移。HepG2轉染實驗證實脂質體和+36GFP蛋白都可攜帶質粒進入細胞，而且質粒上的紅熒光蛋白可以成功表達。在實驗的過程中，我們發(fā)現(xiàn)脂質體轉染會對細胞造成一定的細胞毒作用，而+36GFP蛋白對細胞的生長幾乎沒有影響。激光共聚焦圖片中可觀察到，+36GFP轉染的紅熒光蛋白的表達量要低于脂質體。我們分析出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是+36GFP蛋白攜帶質粒進入細胞后，+36GFP-質粒復合物要經(jīng)歷一個囊泡包裹和蛋白降解的過程，之后質粒被釋放紅熒光蛋白得以表達，這就使得+36GFP轉染需要的時間大于脂質體轉染。為此我們又設計了293細胞轉染實驗，依次增高蛋白相對質粒的比例，然后把轉染時間從24 h延長至48 h，得到了預期的結果。隨著比例的增加，紅熒光蛋白的表達量呈現(xiàn)劑量效應關系。

理想的轉染方法應該具有價廉易得、性質穩(wěn)定、轉染率高、沒有細胞種類差異、沒有細胞毒性等特點，而本文中+36GFP蛋白似乎為我們找到一種理想的轉染方法帶來了一些新啟發(fā)。除了尋找理想轉染方法，+36GFP蛋白的許多特性也使我們看到了它巨大的應用前景。其實David R.Liu博士這種通過替換蛋白非保守氨基酸，重構蛋白表面電荷的方法，也可以應用于其他蛋白，可能為研究其他蛋白并賦予其細胞穿透性及抗凝聚等新特征提供一種非常新穎又有效的策略。

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