潘佳林，王輅，李端華，葉麗娟

中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052

頭孢曲嗪為半合成的廣譜口服頭孢菌素，對b-內(nèi)酰胺酶具有很高的穩(wěn)定性[1]。用于制備頭孢曲嗪的原料成本低于頭孢克洛，臨床療效與頭孢克洛類似[2]。因此，頭孢曲嗪可作為頭孢克洛的替代品種，市場潛力巨大。目前頭孢曲嗪的制備方法主要為化學(xué)方法，一方面殘留的溶劑威脅患者的用藥安全，另一方面產(chǎn)生的廢棄溶媒造成一定的環(huán)保壓力。室溫條件下和在中性水溶液中進(jìn)行的酶催化合成具有更高的能效和更低的碳排放量[3]，利用酶法合成路線代替化學(xué)合成路線可以產(chǎn)生巨大的環(huán)境和社會效益[4-5]。

雖然近年來酶法合成頭孢類抗生素的研究比較廣泛[6-8]，但目前還沒有關(guān)于頭孢曲嗪酶法合成工藝的文獻(xiàn)報道。a-氨基酸酯水解酶(a-Amino acid ester hydrolase，簡稱 AEH，EC 3.1.1.43) 是一類具備頭孢曲嗪合成活性的酶。1972年由Takahashi等在尋找能夠合成帶a-氨基的抗生素的過程中被發(fā)現(xiàn)[9]。由于底物范圍限于帶a-氨基的?；w，而且相比酰胺，對酯的親和性更高而得名[10]。AEH同時催化3個反應(yīng) (圖1)：1)催化酰胺鍵的形成，酶發(fā)揮抗生素合成酶活性；2)催化?；w的水解；3)催化產(chǎn)物的水解，酶發(fā)揮酰胺酶活性[11]。酶法合成頭孢類抗生素可以通過熱力學(xué)控制 (Thermodynamically controlled synthesis，TCS)[12]或者動力學(xué)控制(Kinetically controlled synthesis，KCS)[13]來實現(xiàn)。與熱力學(xué)合成不同，動力學(xué)控制最終的轉(zhuǎn)化率不是由平衡狀態(tài)決定，而是由3個反應(yīng)的速率共同決定[14]。動力學(xué)控制的反應(yīng)其特點(diǎn)是存在暫時的最大轉(zhuǎn)化率[15]。由于產(chǎn)物濃度不再受反應(yīng)平衡的限制，對于高轉(zhuǎn)化率意味著低成本的制藥工業(yè)來說，動力學(xué)無疑是比熱力學(xué)更好的策略。本文從AEH的異源表達(dá)開始，采用純化的重組酶催化合成頭孢曲嗪，以動力學(xué)控制策略考察了特定條件下頭孢曲嗪的轉(zhuǎn)化率。

圖1 AEH催化的頭孢曲嗪的合成Fig. 1 Synthesis of cefatrizine by AEH.

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

紅紋黃單胞菌 Xanthomonas rubrillineans CPCC 140817由中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所保藏；E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化公司?？寺≥d體pGEM-T、表達(dá)載體pET28分別為Promega公司和Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 引物與試劑

引物合成與測序由上海 Invitrogen公司完成。用于克隆的聚合酶為上海生工生物工程公司Pfu聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自Fermentas公司，質(zhì)粒小量提取采用Bio-Tek公司的OMEGA試劑盒。BCA蛋白含量測定試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。親和層析柱 (FF crude，5 mL)購自GE Healthcare公司。超濾離心管 (Amicon，Ultra-15，50 kDa)為 Millipore公司產(chǎn)品。Sephadex G-200購自Pharmacia公司。

頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品購自石家莊華北制藥集團(tuán)。7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸 (7-ADCA)、苯苷氨酸甲酯鹽酸鹽 (PGM·HCl)、對羥基苯苷氨酸甲酯鹽酸鹽 (HPGM·HCl)為上海邦成化工有限公司產(chǎn)品，7-氨基-3-(1, 2, 3-三唑-4-硫基)甲基頭孢烷酸 (7-ATTC)及頭孢曲嗪標(biāo)準(zhǔn)品由四川抗菌素工業(yè)研究所化學(xué)部提供 (純度≥98%)。其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 aeh基因的克隆及轉(zhuǎn)化大腸桿菌

采用 PCR擴(kuò)增方法從紅紋黃單胞菌X. rubrillineans CPCC 140817的全基因組中分離aeh基因。引物序列如下: 正向: 5'-CGGAATTC A TGCGCCGCATCGCTCCCTGCCTGC-3', 反向:5'-CCGCTCGAGTCAATGTACCGGCAGCTGAT GAAAC-3' (下劃線為限制性酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA約100 ng，引物10 pmol/L，dNTPs 200 pmol/L，1×PCR緩沖液，Taq酶 1.5 U，ddH2O補(bǔ)足總體系至25 μL。梯度PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s，50～58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，20 個循環(huán)；72 ℃，10 min。將 PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體中，測序驗證后，再將pGEM-T-aeh和 pET28載體經(jīng)EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切后回收，相連并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)。

1.3.2 重組AEH的酶活測定

以頭孢氨芐合成活性跟蹤 AEH的純化過程。頭孢氨芐合成活性測定方法如下：30 mmol/L 7-ADCA、15 mmol/L PGM·HCl溶于 50 mmol/L pH 6.2的磷酸鈉緩沖液，酶的加量為50 μL酶溶液/(mL反應(yīng)混和物)，30 ℃下溫育30 min。1 min生成1 μmol頭孢氨芐所需的酶量定義為1個活力單位 (1 U)。HPLC 法測定反應(yīng)生成頭孢氨芐的量[16]。

1.3.3 重組AEH的表達(dá)及分離純化

在10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組大腸桿菌。培養(yǎng)液裝量6 L，培養(yǎng)液組成：乳糖1 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，卡那霉素30 mg/L，聚醚消泡劑1 mL/L。接種量1%。發(fā)酵條件：溫度25 ℃；通氣量9 L/min；攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min。發(fā)酵周期24 h。

發(fā)酵結(jié)束后，冷凍離心機(jī)5 000×g離心收集菌體。參考Sambrook的方法[17]制備無細(xì)胞提取物。表達(dá)的蛋白N-端帶有6×His標(biāo)簽，選擇親和層析純化無細(xì)胞提取物。6個柱體積的結(jié)合緩沖液 (20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)洗柱后，以5 mL/min流速上樣。依次用洗滌緩沖液 (10 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)、洗脫緩沖液(50 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)洗柱，分布收集洗脫液。最后用含有更高濃度咪唑的緩沖液洗柱 (200 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)。經(jīng)過SDS-PAGE分析，合并目標(biāo)蛋白純度較高的收集管，超濾離心管去除小分子鹽并濃縮酶溶液。

分離純化每一步獲得的酶液按 1.3.2項下測量酶活。Pierce BCA蛋白含量測定試劑盒測定蛋白含量。

1.3.4 重組AEH亞基分子量的測定

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定亞基分子量。SDS-PAGE分析條件：10%分離膠，5%濃縮膠，上樣量15 μL。采用Bio-Rad公司Powerpac Basic電泳系統(tǒng)，分子量標(biāo)準(zhǔn)為 Fermentas PageRuler Prestained Protein Ladder，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.3.5 重組AEH合成頭孢曲嗪最適反應(yīng)pH與最適反應(yīng)溫度的確定

采用不同pH值的緩沖體系，分別測定重組AEH合成頭孢曲嗪的反應(yīng)初速度，確定重組AEH催化頭孢曲嗪合成的最適pH值。30 mmol/L 7-ATTC、15 mmol/L HPGM×HCl溶于 50 mmol/L不同pH的緩沖液。pH 5.5～6.0，采用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液；pH 6.5～7.5，采用 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。酶加量為50 μL酶溶液/(mL反應(yīng)混和物)，30 ℃下溫育30 min。測定生成的頭孢曲嗪的量。

在最適 pH條件下，測定不同溫度下重組AEH催化頭孢曲嗪合成的反應(yīng)過程。30 mmol/L 7-ATTC、15 mmol/L HPGM×HCl溶于 50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液 (pH 6.0)，酶加量為50 μL酶溶液/(mL反應(yīng)混和物)，分別在28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃下溫育180 min，測定生成的頭孢曲嗪的量。

1.3.6 兩底物最佳摩爾比的確定

底物溶液配置：以初始反應(yīng)體積100 mL計算所需2種底物的量。0.3 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)溶解0.94 g 7-ATTC (30 mmol/L)，緩慢滴加少量1 mol/L NaOH幫助溶解，pH計監(jiān)控溶解過程pH不超過8.0。緩慢加入HPGM×HCl，攪拌溶解，0.3 mol/L的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.2)定容至 96 mL (加入酶溶液后初始反應(yīng)體系約為100 mL)。用1 mol/L NaOH調(diào)整pH至6.0。

催化反應(yīng)：向底物混合物中加入酶液開啟反應(yīng)，酶加量為 22 U/(mL反應(yīng)體系)。酶反應(yīng)在36 ℃，pH為(6.0±0.1)的條件下進(jìn)行，以pH自動控制器控制pH并自動流加1 mol/L NaOH，記錄所加NaOH的體積，用于計算即時反應(yīng)體積。取樣初始反應(yīng)混和物，HPLC測定2種底物的初始濃度。反應(yīng)過程中間隔取樣，HPLC分析反應(yīng)體系中各組分濃度。

1.3.7 HPLC檢測條件

去離子水稀釋反應(yīng)體系中取出的樣品，使?jié)舛冉橛诟鹘M分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。10 000×g離心后，HPLC分析上清液。分析柱：Ultimate XB-18(200 mm×46 mm，5 μm)。流動相：A 相：MeOH；B相：50 mmol/L磷酸銨緩沖液 (pH 2.1)，A∶B=15∶85 (V/V)。B相配置方法：3 mL 85%磷酸溶于950 mL去離子水，25%氨水溶液調(diào)整pH至2.1，去離子水定容至 1 L后混勻備用。流速：1 mL/min，柱溫箱：35 ℃。檢測波長：230 nm。

2 結(jié)果

2.1 重組AEH的克隆、純化與鑒定

PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的條帶 (約2 kb)。經(jīng)回收測序分析，確定為aeh基因，提交GenBank獲得登錄號JF744990。

親和層析步驟中，含50 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液可以將絕大部分AEH洗脫下來。經(jīng)過超濾離心濃縮后的酶溶液經(jīng)SDS-PAGE分析，重組蛋白單亞基的分子量約為 72 kDa，與報道的X. rubrillineans AEH的單亞基分子量一致[18](圖 2)。

大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的重組AEH大約占無細(xì)胞提取物中總蛋白的1%。經(jīng)過3個步驟的提取，從 1 L大腸桿菌的發(fā)酵液中可獲得約1.7 mg 純度為90%的AEH (表1)。

2.2 重組AEH催化合成頭孢曲嗪最適pH和溫度

圖2 經(jīng)純化的重組AEH電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of purified recombinant AEH. M:protein marker; 1: sample of recombinant AEH after affinity chromatography.

表1 大腸桿菌BL21(DE3)中的重組AEH的純化Table 1 Purification of recombinant AEH from E. coli BL21(DE3)

分離自X. rubrillineans的AEH其穩(wěn)定pH范圍介于5.0～8.0[19]。因此將重組AEH催化頭孢曲嗪合成的pH考察范圍定在5.5～7.5。如圖3所示，pH 6.0的緩沖體系中重組AEH催化頭孢曲嗪合成的初速度最高。

考慮到底物溶解度[20]和酶的溫度穩(wěn)定性[21]，將合成反應(yīng)溫度的考察范圍定在28 ℃～40 ℃之間。在 pH為 (6.0±0.1)的條件下，不同溫度下重組AEH合成頭孢曲嗪的反應(yīng)過程如圖4所示，最適溫度下生成的頭孢曲嗪的量標(biāo)準(zhǔn)化為100%。反應(yīng)初速度隨溫度升高而增加，溫度越高，達(dá)到最高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的時間越短。以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，重組AEH頭孢曲嗪合成的最佳溫度為36 ℃。反應(yīng)溫度的選擇需要綜合考慮幾個方面的因素，溫度不僅影響酶催化的速度，也會影響反應(yīng)各組分溶解性及反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。相對較低的溫度可以增加酶及產(chǎn)物穩(wěn)定性，但是達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率的時間可能延長而導(dǎo)致工業(yè)化之后的時間成本增加。

圖3 pH對AEH合成頭孢曲嗪初速度的影響Fig. 3 Effect of pH on initial activity of AEH toward cefatrizine synthesis. The initial activity under optimal pH was standardized to 100%. All synthesis experiments were performed in triplicate by purified enzyme.

圖4 溫度對AEH合成頭孢曲嗪初速度的影響Fig. 4 Effect of temperature on initial activity of AEH toward cefatrizine synthesis. The initial activity under optimal temperature was standardized to 100%. All synthesis experiments were performed in triplicate by purified enzyme.

2.3 兩底物不同摩爾比條件下頭孢曲嗪的合成

反應(yīng)溫度36 ℃，反應(yīng)pH為 (6.0±0.1)的條件下，當(dāng)母核7-ATTC的濃度約為30 mmol/L，側(cè)鏈HPGM×HCl與母核初始摩爾比分別為2.0、2.9和4.1時，頭孢曲嗪的酶法合成實驗結(jié)果見表2。合成轉(zhuǎn)化率ηCFTZ隨著摩爾比的增加而增加。

側(cè)鏈與母核摩爾比為4.1的條件下，整個反應(yīng)過程中底物的減少以及產(chǎn)物的增加見圖5。轉(zhuǎn)化率在150 min到達(dá)峰值，后續(xù)90 min內(nèi)，頭孢曲嗪的濃度基本不變。從工業(yè)角度看該現(xiàn)象非常有利，有足夠的時間終止酶催化反應(yīng)以及進(jìn)行下游過程處理，不必?fù)?dān)心產(chǎn)物的水解。合成轉(zhuǎn)化率最高處，HPGM大約剩余40%，此后的HPGM沒有用于合成頭孢曲嗪，而是緩慢水解為HPG。

圖5也顯示了相對于母核和側(cè)鏈濃度的物質(zhì)平衡情況。整個催化反應(yīng)過程中，含HPG化合物 (HPG+HPGM+頭孢曲嗪)的物質(zhì)平衡非常好，介于 97%～101%之間，含母核化合物(7-ATTC+頭孢曲嗪)的物質(zhì)平衡隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸下降，在最高轉(zhuǎn)化率處，即150 min時為89.9%，至反應(yīng)終止時為81.7%。

表2 重組AEH催化7-ATTC和HPGM合成頭孢曲嗪Table 2 Enzymatic synthesis of cefatrizine from 7-ATTC and HPGM by AEH

圖5 AEH催化的頭孢曲嗪合成動態(tài)過程Fig. 5 Dynamics of cefatrizine synthesis by AEH.Initial masses of 7-ATTC and HPGM were standardized to 100%.

3 討論

由于實驗是產(chǎn)業(yè)化工藝的前期研究，為了保障工藝規(guī)模放大后的重現(xiàn)性，每一次頭孢曲嗪酶法合成實驗都采用 HPLC精確測定底物初始濃度，避免了通過稱量和定容引起的誤差。反應(yīng)過程定量調(diào)節(jié)pH導(dǎo)致的反應(yīng)體積增加，保證對最高轉(zhuǎn)化率時間點(diǎn)處各組分的精確定量。

母核物質(zhì)平衡在整個反應(yīng)過程中呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，可能與母核7-ATTC的某種副反應(yīng)有關(guān)。在所有反應(yīng)混合物樣品的HPLC圖譜中出現(xiàn)了與4個標(biāo)準(zhǔn)品不一致的2個未知的峰 (結(jié)果未顯示)?？梢源_定的是該副反應(yīng)與酶相關(guān)，因為以緩沖液代替酶液的反應(yīng)空白對照并沒出現(xiàn)未知峰，具體是何物質(zhì)有待進(jìn)行收集和解析，以探索排除該副反應(yīng)的可能性。

雖然形成頭孢曲嗪需要的?；荏w (母核7-ATTC)和供體 (HPGM)的摩爾比相等，由于HPGM存在水解副反應(yīng)，HPGM的過量可以提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。這也是通過動力學(xué)控制使反應(yīng)向合成方向進(jìn)行的體現(xiàn)。頭孢氨芐、頭孢唑啉和頭孢克洛也有采用該策略的報道[22]。雖然側(cè)鏈成本低于母核，但顯然無限制升高側(cè)鏈濃度并不是提高轉(zhuǎn)化率的明智選擇。因此實驗選擇的摩爾比范圍介于2∶1～4∶1。下一步將在此基礎(chǔ)上嘗試添加有機(jī)溶劑抑制水解或采用產(chǎn)物絡(luò)合的方法提高合成轉(zhuǎn)化率。

通過本實驗一方面實現(xiàn)了 AEH的異源表達(dá)，為降低酶的生產(chǎn)成本提供了可能；另一方面，確定了反應(yīng)體系中各成分的 HPLC分析方法和物質(zhì)量衡算方法。不過，頭孢曲嗪64.3%的轉(zhuǎn)化率距離實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化還有很長的路要走，可以選擇很多策略來改善轉(zhuǎn)化率，比如：通過分子改造[23]或酶制劑形式[24]提高催化合成頭孢曲嗪的效率，或通過改變反應(yīng)體系使反應(yīng)平衡傾向合成反應(yīng)[25]等等。

[1]Essack SY. The development of β-lactam antibiotics in response to the evolution of β-lactamases. Pharm Res, 2001, 18(10):1391?1399.

[2]Fung-Tomc JC, Huczko E, Stickle T, et al.Antibacterial activities of cefprozil compared with those of 13 oral cephems and 3 macrolides.Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39(2):533?538.

[3]Woodley JM. New opportunities for biocatalysis:making pharmaceutical processes greener. Trends Biotechnol, 2008, 26(6): 321?327.

[4]Bruggink A, Roy PD. Industrial synthesis of semi-synthetic antibiotics//Bruggink A. Synthesis of β-lactam Antibiotics, Chemistry, Biocatalysis and Process Integration. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2001: 13?56.

[5]Volpato G, Rodrigues RC, Fernandez-Lafuente R.Use of enzymes in the production of semi-synthetic penicillins and cephalosporins: drawbacks and perspectives. Curr Med Chem, 2010, 17(32):3855?3873.

[6]Valencia P, Flores S, Wilson L, et al. Batch reactor performance for the enzymatic synthesis of cephalexin: influence of catalyst enzyme loading and particle size. New Biotechnol, 2012, 29(2):218?226.

[7]Sheldon RA. Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 92(3): 467?477.

[8]Bahamondes C, Wilson L, Aguirre C, et al.Comparative study of the enzymatic synthesis of cephalexin at high substrate concentration in aqueous and organic media using statistical model.Biotechnol Bioproc E, 2012, 17(4): 711?721.

[9]Takahashi T, Yamazaki Y, Kato K, et al. Enzymic synthesis of cephalosporins. J Am Chem Soc, 1972,94(11): 4035?4037.

[10]Blum JK, Bommarius AS. Amino ester hydrolase from Xanthomonas campestris pv. campestris,ATTC 33913 for enzymatic synthesis of ampicillin.J Mol Catal B Enzym, 2012, 67(1/2): 21?28.

[11]Barends TRM, Polderman-Tijmes JJ, Jekel PA, et al. The sequence and crystal structure of thea-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri define a new family of b-lactam antibiotic acylases. J Biol Chem, 2003, 278(25):23076?23084.

[12]Schro?n CGPH, Nierstrasz VA, Kroon PJ, et al.Thermodynamically controlled synthesis of β-lactam antibiotics. Equilibrium concentrations and side-chain properties. Enzyme Microb Tech,1999, 24(8/9): 489?506.

[13]Schro?n CGPH, Nierstrasz VA, Moody HM, et al.Modeling of the enzymatic kinetic synthesis of cephalexin-influence of substrate concentration and temperature. Biotechnol Bioeng, 2001, 73(3):171?178.

[14]Diender MB, Straathof AJJ, Heijnen JJ. Predicting enzyme catalyzed reaction equilibria in cosolvent-water mixtures as a function of pH and solvent composition. Biocatal Biotransform, 1998,16(4): 275?289.

[15]Polderman-Tijmes JJ. Biochemical characterization of a-amino acid ester hydrolases[D]. Groningen:University of Groningen, 2004.

[16]Xia DN, Xia YJ, Yin J, et al. Simultaneous determination of cefalexin and trimethoprim in plasma by HPLC. Chin J Antibiot, 2008, 33(11):682?684, 700 (in Chinese).夏登寧, 夏艷姣, 尹佳, 等. HPLC同時測定血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的濃度. 中國抗生素雜志, 2008, 33(11): 682?684, 700.

[17]Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Beijing: Science Press,2002: 1252 (in Chinese).薩姆布魯克 J, 拉塞爾 DW. 分子克隆實驗指南.3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 1252.

[18]Krest'ianova IN, Uvarov NN, Rudenskaia GN, et al.Intracellular aminopeptidase from Xanthomonas rubrilineans, hydrolyzing a-amino acid esters and cefalexin. Biokhimiia, 1990, 55(12): 2226?2238.

[19]Qu F, Yi BX, Ye LJ. Purification and characterization of a-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas rubrillineans. Acta Microbiol Sin, 2012, 52(5): 620?628 (in Chinese).屈鳳, 易八賢, 葉麗娟. 紅紋黃單胞菌a-氨基酸酯水解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì). 微生物學(xué)報,2012, 52(5): 620?628.

[20]Kurochkina VB, Sklyarenko AV, Satarov JE, et al.Ionization constants and solubility of compounds involved in enzymatic synthesis of aminopenicillins and aminocephalosporins. Bioproc Biosyst Eng,2011, 34(9): 1103?1117.

[21]Bluma JK, Rickettsc MD, Bommarius AS.Improved thermostability of AEH by combining B-FIT analysis and structure-guided consensus method. J Biotechnol, 2012, 160(3/4): 214?221.

[22]Nys PS, Kurochkina VB. Methodological approach to development of enzymatic technologies for semisynthetic betalactam antibiotic production.Appl Biochem Biotech, 2000, 88(1/3): 221?229.

[23]Bornscheuer UT, Huisman GW, Kazlauskas RJ, et al. Engineering the third wave of biocatalysis.Nature, 2012, 485(7397): 185?194.

[24]Cecchini DA, Pavesi R, Sanna S, et al. Efficient biocatalyst for large-scale synthesis of cephalosporins, obtained by combining immobilization and site-directed mutagenesis of penicillin acylase. Appl Microbiol Biotechnol,2012, 95(6): 1491?1500.

[25]Feng SX, Liang SZ, Lou WY. Two-step, one-pot enzymatic synthesis of cefprozil from-phenylacetamido-3-propenyl-cephalosporanic acid(GPRA). Biocatal Biotransform, 2008, 26(4):321?326.