趙立平 朱瑪 姜廣路 于霞 黃海榮

目前，結(jié)核病仍然是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一［1］。據(jù) WHO統(tǒng)計(jì)，2002年世界1／3的人口已感染結(jié)核分枝桿菌［2］，據(jù)估算，每年約有200萬例患者死于結(jié)核?。?］。結(jié)核病的早期診斷和快速治療對(duì)疾病的控制至關(guān)重要，診斷的延誤必然導(dǎo)致病情惡化，并增加結(jié)核病傳播的風(fēng)險(xiǎn)［4］。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查的重要方法，被認(rèn)為是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)。目前在我國各級(jí)結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室中，基于羅氏培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)是最常用的培養(yǎng)方法之一。本研究分析采用簡(jiǎn)單法和離心法處理痰標(biāo)本，以及采用離心法處理痰標(biāo)本時(shí)不同離心條件對(duì)羅氏培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的影響，以尋求目前情況下最適合我國結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室操作的技術(shù)。

材料和方法

一、臨床標(biāo)本的來源

選取2010年9月至2010年11月在北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查的疑似結(jié)核病患者痰標(biāo)本198份，其中顯微鏡檢查涂片陽性者99份，涂片陰性者99份；男143例，女55例。年齡范圍10～91歲，平均年齡（48．4±19．9）歲。

二、方法

1．儀器和試劑：恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：SKP08B，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；渦旋振蕩器（型號(hào)：vortex-2，Scientific Industries）；搖床 （型號(hào)：培英HZ-E，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；離心機(jī)（型號(hào)：CR21GⅢ，HITACHI）；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、谷氨酸鈉、枸櫞酸鎂均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2．羅氏培養(yǎng)基的制備：酸性羅氏培養(yǎng)基和中性羅氏培養(yǎng)基的制備參見參考文獻(xiàn)［5］。

3．羅氏培養(yǎng)基簡(jiǎn)單法培養(yǎng)：取1ml痰標(biāo)本，加入1～1．5倍體積4%NaOH溶液進(jìn)行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，振蕩混勻后室溫孵育15min。100μl處理后的樣品直接接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，每份標(biāo)本平行接種2管酸性羅氏培養(yǎng)基。37℃溫箱培養(yǎng)8周，每周觀察記錄結(jié)果。

4．羅氏培養(yǎng)基離心法培養(yǎng)：取1ml痰標(biāo)本，加入1～1．5倍體積 N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉（NaOH-NAC）混合溶液進(jìn)行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，直至痰標(biāo)本充分液化；將離心管室溫靜置15min；加入PBS中和至體積為40ml，分別采用5種不同的離心條件：①3000×g離心15min（一般常規(guī)所用離心條件）；②3000×g離心8min；③3000×g離心25min；④2000×g離心15min；⑤5000×g離心15min。100μl處理后的樣品分別接種至中性羅氏培養(yǎng)基斜面上。每份標(biāo)本平行接種2管中性羅氏培養(yǎng)基。37℃溫箱培養(yǎng)至8周，每周觀察記錄結(jié)果。

5．結(jié)果判定：（1）初生長時(shí)間的判定：首次發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基斜面上有菌落生長的時(shí)間確定為初生長時(shí)間。（2）污染率的判定：以標(biāo)本的份數(shù)為計(jì)算單位，同一份標(biāo)本的2個(gè)接種管均污染時(shí)認(rèn)為污染，若只有單只接種管污染則不認(rèn)為污染。污染率＝污染份數(shù)／樣本數(shù)×100%。

6．質(zhì)量控制（簡(jiǎn)稱“質(zhì)控”）：質(zhì)控菌株 H37Rv（ATCC 27294）為國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室保存菌株，將生長至對(duì)數(shù)期的H37Rv菌株用生理鹽水比濁至0．5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，?ml比濁好的菌液，處理方法同痰標(biāo)本，分別接種100μl至中性或酸性羅氏培養(yǎng)基。若質(zhì)控菌株培養(yǎng)結(jié)果為陽性，說明質(zhì)控合格，否則質(zhì)控結(jié)果不合格。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．不同處理方法的培養(yǎng)結(jié)果和污染率：任何一種方法培養(yǎng)陽性即認(rèn)定標(biāo)本培養(yǎng)陽性，198份痰標(biāo)本中共有126份培養(yǎng)陽性，其中97份來自涂片陽性痰標(biāo)本，29份來自涂片陰性痰標(biāo)本。126份培養(yǎng)陽性的痰標(biāo)本中，簡(jiǎn)單法的培養(yǎng)陽性率93．65%（118／126），與一般常規(guī)所用離心條件（3000×g離心15min）培養(yǎng)陽性率96．03%（121／126）相比，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．146，P＝0．702）。在125份離心法培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中，3000×g離心15min、3000×g離心8min、3000×g離心25min、2000×g離心15min、5000×g離心15min 5種不同離心條件下培養(yǎng)陽性率分 別 為 96．03%、89．68%、95．24%、92．06% 和96．03%（表1）。選取的198份痰標(biāo)本中，簡(jiǎn)單法總體污染率為3．03%（6／198），離心法3000×g離心15min的污染率為3．54%（7／198），兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．074，P＝0．785）。

2．不同處理方法的培養(yǎng)結(jié)果初生長時(shí)間：由于6組不同處理方法的初生長時(shí)間數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布（Kolmogorov-Smirnow正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果，P值均＜0．05），故采用秩和檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。6種不同處理方法初生長時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝187．63，P＜0．001）。再進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較，將α值矯正為0．0033（0．05／15）。簡(jiǎn)單法（118份陽性）與一般常規(guī)所用離心條件3000×g離心15min（121份陽性）的初生長時(shí)間之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝-4．81，P＜0．001）。5種不同離心條件下初生長時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝118．73，P＜0．001）。其余4種離心條件下的初生長時(shí)間與簡(jiǎn)單法的比較結(jié)果如表2所示。

表1 標(biāo)本不同處理方法處理后的羅氏培養(yǎng)結(jié)果

表2 標(biāo)本不同處理方法處理后的結(jié)核分枝桿菌初生長時(shí)間

討 論

結(jié)核分枝桿菌的病原學(xué)檢查是結(jié)核病臨床診斷的最重要的依據(jù)［6］。目前我國結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室仍以痰涂片顯微鏡檢查和分枝桿菌羅氏培養(yǎng)最為常用。痰涂片顯微鏡檢查雖簡(jiǎn)單、快速，但敏感度較低，痰涂片檢查陽性只能說明痰中含有抗酸桿菌，不能區(qū)分死菌與活菌。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)相對(duì)于涂片顯微鏡檢查具有較高敏感度，目前仍然作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，并且結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)還是后續(xù)開展的藥物敏感度試驗(yàn)、分枝桿菌菌種鑒定、基因分型，以及各種基礎(chǔ)研究的前提。培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)還體現(xiàn)在，能夠針對(duì)各種臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，包括痰液、胸、腹腔積液、腦脊液、尿液和膿液等?；谝陨显?，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)在未來仍將作為一項(xiàng)重要的診斷技術(shù)，所以，對(duì)這項(xiàng)傳統(tǒng)技術(shù)的全面評(píng)價(jià)，并著力于提高技術(shù)的診斷效率，仍然有很大的現(xiàn)實(shí)意義。

羅氏培養(yǎng)中離心法是先對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)的離心等技術(shù)處理，以便對(duì)其中的細(xì)菌進(jìn)行沉淀濃縮，從理論上講可提高標(biāo)本培養(yǎng)的陽性率。den Hertog等［7］發(fā)現(xiàn)不恰當(dāng)?shù)碾x心（轉(zhuǎn)速過低或是時(shí)間過短）均會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)陽性率的降低，同時(shí)認(rèn)為離心的最低條件為3200×g離心22min，但該實(shí)驗(yàn)缺少臨床標(biāo)本的數(shù)據(jù)支持。本研究首次就臨床標(biāo)本在不同離心條件對(duì)離心法培養(yǎng)的影響進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同離心條件下結(jié)核分枝桿菌的初生長時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝118．73，P＜0．001），離心力或離心時(shí)間降低均會(huì)導(dǎo)致初生長時(shí)間延長。但不同離心條件下，陽性率有明顯差別，3000×g離心15min、3000×g離心8min、3000×g離心25min、2000×g離心15min、5000×g離心15min，5種不同離心條件下培養(yǎng) 陽 性 率 分 別 為 96．03%、89．68%、95．24%、92．06%、96．03%。由此可知當(dāng)離心力或是離心時(shí)間降低均對(duì)陽性率有影響。

離心法3000×g離心15min和簡(jiǎn)單法在初生長時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝-4．81，P＜0．001），且簡(jiǎn)單法的平均生長時(shí)間比離心法要短2d。簡(jiǎn)單法總體污染率為3．03%（6／198），離心法3000×g離心15min的污染率為3．54%（7／198）。

綜上所述，羅氏培養(yǎng)過程中，簡(jiǎn)單法檢出陽性率與離心法接近，但簡(jiǎn)單法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、污染率較低，初生長時(shí)間也相對(duì)較短，因而可能更符合臨床的需要；應(yīng)用離心法進(jìn)行羅氏培養(yǎng)時(shí)，無論是離心力或是離心時(shí)間的變化對(duì)培養(yǎng)的陽性檢出率均有影響。

［1］World Health Organization． Global tuberculosis control，WHO report 2002．Geneva：World Health Organization，2002．

［2］Sudre P，ten Dam G，Kochi A．Tuberculosis：aglobal overview of the situation today．Bull World Health Organ，1992，70（2）：149-159．

［3］Frieden TR，Sterling TR，Munsiff SS，et al．Tuberculosis．Lancet，2003，362（9387）：887-899．

［4］Sreeramareddy CT，Panduru KV，Menten J，et al．Time delays in diagnosis of pulmonary tuberculosis：a systematic review of literature．BMC Infect Dis，2009，9：91．

［5］World Health Organization．Laboratory services in tuberculosis control．Part III：Culture．Geneva：World Health Organization，1998．

［6］馬玙，朱莉貞，潘毓萱．結(jié)核?。本喝嗣裥l(wèi)生出版社，2006：104-109．

［7］den Hertog AL，Klatser PR，Anthony RM．Buoyant density of Mycobacterium tuberculosis：implications for sputum processing．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（4）：466-471．