蔡彥韜(綜述) 陳宗祐(審校)

(復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是最常見的消化道腫瘤之一，死亡率位居惡性腫瘤第2位，超過50%的CRC患者最終死于腫瘤遠處轉移相關的并發(fā)癥。CRC的轉移是一個復雜的多步驟綜合的生物學過程，包括有腫瘤細胞抗凋亡、上皮細胞間質化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、增殖侵襲及血管生成等，多種因子交雜成信號網(wǎng)絡參與調(diào)控。對于轉移相關調(diào)控因子的探索研究將為今后CRC的早期診斷及綜合治療提供理論依據(jù)和進一步科研方向。

microRNA(miRNA)是一組長度19到22核苷酸的非編碼序列RNA，參與細胞分化、細胞周期調(diào)節(jié)、應激以及凋亡等諸多重要細胞程序過程中的基因表達調(diào)控，多達30%的人類基因受到miRNA的調(diào)控［1］。隨著微陣列技術及RT-PCR的發(fā)展，關于miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究正成為科研熱點，以乳腺癌為代表的腫瘤學研究已證明miRNA參與多種腫瘤轉移過程中某些關鍵步驟的調(diào)節(jié)［2］。而目前類似的研究在CRC中相對較少，由于miRNA表達具有高度組織特異性，所以盡管近年在分子生物學、組織學等方面取得了一定進展，其在CRC轉移過程中的作用及機制仍需要更多的研究結果加以支持。本文通過miRNA在凋亡、上皮細胞間質化、血管生成及細胞內(nèi)信號轉導等方面進行闡述，對近年miRNA在CRC轉移各通路中的作用與機制的研究進展進行綜述。

miRNA合成流程 miRNA在基因組DNA上有各自對應的區(qū)域。這些DNA在RNA聚合酶II的作用下得到轉錄產(chǎn)物，稱為初級miRNA分子(primary miRNA，pri-miRNA)。pri-miRNA被核酸內(nèi)切酶III-Dorsha及其輔助因子DGCR8加工為前體miRNA(precursorpre-miRNA，pre-miRNA)，premiRNA具有莖環(huán)結構，長度約為40個核苷酸，通過輸出蛋白5(exportin-5)的協(xié)作，從細胞核被運輸至胞質。胞質內(nèi)的RNA酶III(Dicer)將pre-miRNA的莖環(huán)結構切開，使之成為miRNA雙鏈體結構，隨后雙鏈結構迅速降解為單鏈結構的miRNA，即成熟的miRNA。成熟的miRNA結合到RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)發(fā)揮其生物效應。RISC通過堿基不完全配對結合至靶mRNA的 3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)，抑制靶mRNA翻譯過程或介導靶mRNA的降解［3］。

miRNA通過堿基不完全配對可與多種靶mRNA結合?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的1 000種左右miRNA參與超過5 300種人類基因的調(diào)控，占到人類基因的 30%［4］。

miRNA受多種方式的調(diào)節(jié)，包括miRNA基因區(qū)域的過甲基化，組蛋白修飾以及SNP調(diào)節(jié)，以上調(diào)節(jié)方式在腫瘤相關miRNA的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

miRNA與CRC細胞凋亡 腫瘤細胞凋亡通過外源性及內(nèi)源性途徑完成。外源性途徑依靠細胞膜上凋亡受體(FASL，TRAIL，TNFR)與配體結合，激活下游caspase8，引發(fā)“瀑布反應”導致凋亡。內(nèi)源性途徑以線粒體作為調(diào)控核心，在上游BCL-2家族蛋白的調(diào)解下釋放線粒體蛋白，包括參與caspase9構成的細胞色素C(cytochrome C，cyt C)，從而激活下游caspase的“瀑布反應”。

P53作為促使腫瘤細胞凋亡的重要蛋白，參與多種miRNA的調(diào)控。這種調(diào)控自轉錄及轉錄后階段影響許多mRNA的翻譯，與這些靶mRNA匹配的miRNA也隨之受到調(diào)控［5］。相反，P53亦受一些miRNA的調(diào)節(jié)，如 miR29家族，包括 miR29a，miR29b，miR29c，通過作用于CDC42及p85a對P53起到正向調(diào)節(jié)作用，促P53水平升高起到促進對于惡變細胞的凋亡誘導［6］。

miR34家族是 TP53的直接下游靶基因［7］。Tazawa等［8］報道CRC細胞受miR34a轉染后誘導細胞進入衰老凋亡狀態(tài)，細胞內(nèi)p53表達升高，促癌因子E2F下調(diào)，且這種調(diào)控在p53缺失的腫瘤細胞中無效，證明TP53也是miR34a發(fā)揮抑癌效應的可能作用靶位。由此可以推測p53與miR34a間存在正向調(diào)節(jié)的環(huán)路，兩者相互促進發(fā)揮促癌細胞凋亡效應［9］。另有研究通過翻譯寡核苷酸轉染法去除miR34a功能的小鼠胚胎干細胞，證明凋亡通路中的BCL-2蛋白家族直接受miR34a的負向調(diào)節(jié)［10］。miR34基因的丟失導致腫瘤細胞的抗凋亡，在臨床上顯示為對促凋亡化療藥物的敏感性下降［11］。同樣作用于BCL-2其促凋亡效果的的還有 miR195［12］。

巨噬細胞遷徙抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種在細胞免疫、炎癥反應中的重要因子，在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及缺氧誘發(fā)的凋亡過程中發(fā)揮重要作用，且已被證明具有抑制p53活性的效應［13－14］。MIF是miR451的潛在靶點，Bandrés等［15］通過活檢標本的檢測，觀察到消化道腫瘤中過表達的miR451同時抑制MIF的mRNA及蛋白表達，具有抑制腫瘤生長的效果。

miRNA與CRC細胞的EMT EMT是體內(nèi)將具有極性且活動性弱的上皮細胞轉變?yōu)槭O性而活動性強的間質細胞的一種細胞程序，是腫瘤細胞適應微環(huán)境改變的途徑，致其脫離瘤體，進入脈管系統(tǒng)發(fā)生轉移及播散。

腫瘤細胞生長過程中合成釋放的轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)是 EMT 中最主要的促進因子，能夠強烈增加促鋅指結合蛋白(zincfinger-enhancer binding protein，ZEB)的表達水平，下調(diào)E鈣黏蛋白而上調(diào)波形蛋白(vimentin)水平，使腫瘤細胞發(fā)生失極性，黏附力下降以及活動能力提高，促進細胞自瘤體脫落進入循環(huán)［16－17］。

EMT與miRNA有相當密切的關系，miR200家族在其中的地位尤其重要。發(fā)生EMT的CRC細胞內(nèi)存在miR200水平的下降。進一步實驗證實低水平miR200環(huán)境下，胞內(nèi)促進胞間緊密連接的E鈣黏蛋白水平降低，促進EMT發(fā)生的波形蛋白水平則升高，腫瘤細胞呈EMT趨勢;相反，高水平miR200轉染腫瘤細胞，則可觀察到E鈣黏蛋白水平升高及細胞上皮化(enchymal-epithelial tranition，MET)趨勢。ZEB蛋白被認為是miR200抑制EMT效應的靶位，同時具有抑制miR200效應，兩者構成互相抑制的環(huán)路，使 miR200 在 EMT 中更顯重要［18－19］。

除miR200家族外，miR21也參與腫瘤細胞EMT的過程。CRC細胞中 miR21所在基因區(qū)域的拷貝增加較常見，在CRC轉移株中則更普遍。組織學研究證實CRC肝轉移組織內(nèi)miR21水平顯著高于原位CRC組織［20］。TGFβ可能是miR21的上游因子，依據(jù)來自高水平TGFβ處理CRC后可觀察到 miR21表達增加［21］。miR21在CRC中促進EMT的機制可能與抑制程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)有關，Selcuklu等［22］在 miR21 基因區(qū)敲除后的腫瘤細胞中觀察到PDCD4表達升高且侵襲性下降，這種反向關系在CRC組織中也得到了證實［23］。

miRNA與CRC血管生成 血管生成是腫瘤發(fā)生轉移過程中的重要步驟。缺氧是誘發(fā)新生血管生成最主要的因素，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是其中最關鍵的細胞因子。當腫瘤組織出現(xiàn)缺氧時，缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)即刻高表達。HIF-1刺激VEGF-A mRNA高表達，隨即VEGF-A組織水平升高，同時出現(xiàn)VEGF受體表達升高，以此介導新生血管形成以對抗缺氧，且為瘤細胞脫落遷徙提供途徑［24］。

多種miRNA可能參與上述缺氧-HIF-VEGF通路的調(diào)控。Yamakuchi等［25］發(fā)現(xiàn)結腸癌組織中miR22水平低于正常組織，并證實CRC細胞內(nèi)高水平的 miR22可抑制HIF1a的表達，下游VEGF的表達減少;相反，敲除內(nèi)源性 miR22后則觀察到HIF1a和VEFG水平的升高。故可以明確miR22作用于HIF1a，抑制CRC細胞內(nèi)缺氧誘導的血管生成效應。

miR619作用于VEGF基因，上調(diào)VEGF蛋白合成促進腫瘤血管生成，且miR619本身受VEGF蛋白正向調(diào)控，兩者構成正向反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。而抗VEGF處理的 CRC細胞，其 miR619水平亦發(fā)生下調(diào)［26］。

抑癌基因TP53對于腫瘤血管生成存在抑制效應，促腫瘤細胞進入凋亡程序。miR107定位于染色體10q23．31區(qū)，在11%的CRC患者中存在該區(qū)域的缺失［27］。TP53可促進下游的miR107表達增加，后者結合mRNA抑制HIF-1的翻譯以抑制腫瘤血管生成［28］。缺氧處理的CRC細胞中，高miR107水平組其VEGF顯著低于低miR107水平組。動物試驗也證實高miR107導致VEGF低表達，低血管密度以及低腫瘤大小的特點。

miRNA與CRC細胞內(nèi)信號傳導 腫瘤細胞通過多條胞內(nèi)信號傳導通路傳遞以獲得增殖、侵襲及遷徙能力，KRAS途徑是其中最重要的一條通路。Let-7家族是最早被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，其作用位點在KRAS上，抑制KRAS的表達起到抑癌作用。Akao等［29］報道let-7miRNA在CRC組織中多呈低表達。let-7轉染CRC細胞后，在翻譯水平下調(diào)胞內(nèi)KRAS以及促腫瘤血管生成的c-myc蛋白水平，阻止新生血管形成。

miRNA143定位于染色體5q32，CRC標本中5q24-32區(qū)常發(fā)生丟失，miR143于腫瘤組織內(nèi)低表達［21，30］。miRNA143前體轉染入CRC細胞導致KRAS通路下游因子ERK5蛋白水平的下降，盡管具體作用靶點尚不清楚，其抑制RAS通路發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用是可以肯定的［20，31］。

miR17/92受c-myc蛋白正調(diào)控，對CRC細胞使用miR17/92轉染以及基因區(qū)敲除實驗，證明其直接下調(diào)抑癌因子，即抗血管生成蛋白1(antiangiogenic thrombospondin-1，Tsp1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的合成，促進CRC侵襲與轉移［32］。

酪氨酸激酶受體激活通過PI3K-AKT途徑激發(fā)腫瘤細胞內(nèi)抗凋亡反應，也是腫瘤細胞生存、轉移所依賴的重要細胞通路。Schimanski等［33］通過miR196轉染CRC細胞觀察到AKT磷酸化的增高，說明miR196作用下PI3K-AKT途徑受到促進。此外miR196在CRC轉移組織中的水平高于原位組織，都說明其促進CRC轉移的作用。

總結與展望 本文總結了miRNA在CRC轉移中各通路中的作用機制與靶位(表1)。

表1 CRC轉移相關miRNA在CRC中的表達、作用機制及靶點Tab 1 miRNA involved in metastasis of CRC-functions and targets

有關miRNA與CRC轉移的研究在逐漸揭示CRC發(fā)生遠處轉移的機制同時，也為將來CRC的早期診斷、預后評估及靶向治療等領域照亮了前路。隨著微陣列技術與qRT-PCR的發(fā)展與普及，miRNA可作為腫瘤標志物對腫瘤發(fā)生以及腫瘤轉移進行早期診斷，針對特定miRNA的干預有望提高化療藥物對于CRC原發(fā)灶及轉移灶的治療敏感性，靶向干預miRNA也可作為新理念用以開發(fā)新型化療藥物。隨著越來越多實驗及臨床證據(jù)的積累，miRNA在CRC轉移過程中的機制逐漸被揭示，也為CRC轉移的臨床診斷及治療提供了美好的發(fā)展前景。

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