汪路曼 錢 靜 劉小明 常麗君 儲以微

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 上海 200032)

人類炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種腸道免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所致的腸道炎癥損傷性病變，包括克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確［1－2］。葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠腸道損傷是人類炎性腸病的實驗性動物模型。其病程可分為炎癥加重期(第1～10天)和炎癥緩解期(第11天后)，主要癥狀為腹瀉、便血和體重減輕，病理學(xué)表現(xiàn)為全結(jié)腸的炎性細(xì)胞浸潤和糜爛［3－5］。

作為機體中一類重要的免疫細(xì)胞，B細(xì)胞在免疫和炎癥反應(yīng)中行使著多種功能。B細(xì)胞不僅可以介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮正性免疫調(diào)節(jié)作用，近年來的研究顯示B細(xì)胞中還存在著發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞亞群［6－7］。CD19+CD5+CD1dhiB 細(xì)胞是新近報道的一種發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的B細(xì)胞，其免疫調(diào)節(jié)作用已在多種疾病模型中得到證實［8－9］。然而有關(guān)這類B細(xì)胞在腸炎模型中的研究不多，尤其在疾病過程中其數(shù)量比例以及功能的動態(tài)變化尚不清楚。因此，本文擬以DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎為研究模型，聚焦CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞，通過流式檢測其在疾病發(fā)展中的比例變化，分析其在疾病進(jìn)程中的抑炎作用，為臨床IBD的研究和疾病的治療提供新思路。

材料和方法

實驗動物及試劑 8～12周雌性C57BL/6小鼠(200只)購于斯萊克公司，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。相對分子質(zhì)量(Mr)為36 000～50 000的DSS購自美國MP Biomedicals公司;脂多糖(LPS)、離子霉素(Ionomycin)、佛波酯(PMA)均購自美國Sigma公司;莫能星(monensin)，抗 CD16/CD32 Fc block，F(xiàn)ITC-抗 CD19，IFN-γ，TNF-α和IL-6 ELISA抗體均購自美國eBioscience公司;PE-抗CD5和Alexa flour 647-抗CD1d購自美國Biolegend公司。

腸炎模型的誘導(dǎo)以及疾病評價 給予雌性C57BL/6小鼠含有3．5%DSS的飲用水，7天后改成正常飲用水。根據(jù)文獻(xiàn)報道及實驗指標(biāo)，第0～10天為腸炎急性期，第11～25天為腸炎消退期，分別在第8天和第12天處死小鼠，作為不同階段的實驗組，未飲用3．5%DSS水的小鼠作為健康對照組，每組至少5只小鼠。疾病臨床評分(disease activity index，DAI)包括體質(zhì)量下降的程度、大便性狀以及有無便血。小鼠在不同時間點處死后，取腸組織固定在10%甲醛中，用切片機將其切成5 μm厚度，蘇木精-伊紅染色并進(jìn)行病理學(xué)評分:0分，正常;1分，輕度炎癥，散在的單個核細(xì)胞浸潤;2分，中度炎癥，多發(fā)性病灶;3分，重度炎癥，血管增生以及腸壁顯著增厚;4分，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，伴隨透壁性炎性細(xì)胞浸潤以及腸道杯狀細(xì)胞脫落。每只小鼠的腸道組織觀察4個視野，取平均值作為該小鼠的病理學(xué)評分。

流式檢測脾細(xì)胞中CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的表達(dá) 不同時間點的小鼠斷頸處死，70%酒精浸泡消毒后，取小鼠脾臟，研磨成單個細(xì)胞后重懸于PBS緩沖液中，置于15 mL離心管并插于冰盒中。1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入10 mL RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計數(shù)。取1×106細(xì)胞于流式管中，加入封閉細(xì)胞Fc端的抗體抗 CD16/CD32 ，4℃、15 min后加入抗 CD19、抗CD5、抗CD1d抗體，4℃下避光反應(yīng) 30 min，洗滌2次(1 500 r/min，離心5min)，加入流式洗滌液300 μL重懸，用流式細(xì)胞儀分析。

體內(nèi)轉(zhuǎn)輸實驗 如前所述，不同時間點的小鼠斷頸處死，脾細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用流式抗體抗CD19、抗CD5、抗CD1d抗體染色后，用細(xì)胞分選儀分選出 CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞。將1×106/100 μL濃度的細(xì)胞通過尾靜脈轉(zhuǎn)輸?shù)紻SS誘導(dǎo)1天的小鼠體內(nèi)，PBS組作為陰性對照。觀察小鼠的體重變化，給予DAI評分。

局部細(xì)胞因子的檢測 取轉(zhuǎn)輸了CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的DSS小鼠局部腸組織，加入含蛋白酶抑制劑的PBS碾碎后，離心(12 000×g，20 min)取上清，用ELISA試劑盒檢測腸局部IFN-γ，TNF-α和IL-6的表達(dá)。

統(tǒng)計學(xué)分析 用統(tǒng)計軟件 Prism 5．0分析，兩組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用 One-way ANOVA檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

小鼠腸炎模型的疾病評估 對經(jīng)DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠分別進(jìn)行體質(zhì)量、臨床評分(DAI)以及病理學(xué)評分，結(jié)果顯示:第0～10天，小鼠體質(zhì)量減輕，DAI疾病指數(shù)升高，病理學(xué)切片發(fā)現(xiàn)腸壁有大量炎癥細(xì)胞浸潤，腸黏膜受損、腸腺體杯狀細(xì)胞減少(放大倍數(shù):200×)，病理學(xué)評分增高，表明0～10天是小鼠腸炎的疾病加重期;而11天后，小鼠體質(zhì)量回升、DAI及病理學(xué)評分則逐步下降，提示11天以后為疾病的恢復(fù)期(圖1A～C)。

腸炎病程中CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的改變我們首先檢測了腸炎小鼠脾臟中B細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，DSS處理組B細(xì)胞比例增加(P=0．046 4，t=2．849，圖2A)。隨后，我們對于代表正常(第0天)、炎癥急性期(第8天)以及炎癥恢復(fù)期(第12天)小鼠脾細(xì)胞中的CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的比例分別進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在炎癥急性期，脾細(xì)胞中的CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的比例明顯增加(P=0．000 9，F(xiàn)=28．13，圖2B)。

圖1 DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型(×200)Fig 1 DSS-induced inflammatory bowel disease model(×200)

圖2 腸炎小鼠脾臟中CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的比例變化Fig 2 The proportion change of splenic B cells and CD19CD5CD1dB cells in DSS-induced inflammatory bowel disease

CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞在炎癥不同時期的功能差異 為了探究CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞在炎癥不同階段的功能改變，我們在DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中分選第0、8和12天小鼠脾細(xì)胞中CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)輸?shù)紻SS誘導(dǎo)的急性期小鼠體內(nèi)(圖3A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有轉(zhuǎn)輸了第8天即炎癥急性期的CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞能使小鼠急性腸炎癥狀得到減輕，而轉(zhuǎn)輸了第0天和第12天的CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞，小鼠腸炎癥狀無明顯改善(圖3B)。提示在腸炎急性期，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的抑炎功能增強。

CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞對腸道炎性因子的影響 IFN-γ，TNF-α和IL-6是小鼠腸炎模型中腸道重要的炎性因子，為了驗證CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞對于它們的作用，我們分別檢測了轉(zhuǎn)輸PBS對照組和炎癥急性期CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的小鼠腸道局部炎性因子的變化。結(jié)果表明轉(zhuǎn)輸CD19+CD5+CD1dhiB 細(xì)胞可明顯下調(diào) IFN-γ、TNF-α 和IL-6的分泌(圖4)，提示下調(diào)局部炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生很有可能是CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機制之一。

圖3 體內(nèi)轉(zhuǎn)輸CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的抑炎作用Fig 3 CD19+CD5+CD1dhiB cells suppress disease symptoms in DSS-induced inflammatory bowel disease

圖4 CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞抑制腸道炎性因子的分泌Fig 4 The secretion of inflammatory cytokine in local intestine after CD19+CD5+CD1dhiB cells adoptive transfer

討 論

我們的研究表明，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞可能在小鼠腸炎模型中發(fā)揮著重要的保護(hù)性作用。脾臟中CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的比例與腸炎的嚴(yán)重程度正相關(guān);體內(nèi)轉(zhuǎn)輸CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞可有效控制疾病的進(jìn)展，改善疾病的癥狀;CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的轉(zhuǎn)輸可明顯降低腸道局部炎性細(xì)胞因子的分泌。以上結(jié)果表明，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞可通過抑制腸道炎性細(xì)胞因子的分泌在小鼠腸炎模型中發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)只有疾病急性期(第8天)的CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞才具備有效的抑炎作用，疾病的初始期(第0天)及恢復(fù)期(第12天)，此類細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能不明顯，提示CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的功能變化也與小鼠腸炎病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。這與文獻(xiàn)報道［10］相吻合:研究表明，正常小鼠體內(nèi)CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞不具備抑制作用，只有處于炎癥環(huán)境中，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的免疫功能才能被激活，從而起到緩解和調(diào)節(jié)疾病的作用。本研究中，處于健康狀態(tài)的第0天，小鼠CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞處于“靜息”狀態(tài)，因而不具備調(diào)節(jié)功能;而在第8天，炎癥處于急性期，CD19+CD5+CD1dhiB被“激活”，產(chǎn)生了調(diào)節(jié)性作用;轉(zhuǎn)輸實驗表明，外源性增加CD19+CD5+CD1dhiB可以緩解疾病的癥狀，但是其調(diào)節(jié)疾病的途徑目前存在爭議。文獻(xiàn)表明IL-10是CD19+CD5+CD1dhiB調(diào)節(jié)疾病的主要方式，然而越來越多的證據(jù)表明，CD19+CD5+CD1dhiB及其他類型的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞通過IL-10非依賴的方式協(xié)同其他調(diào)節(jié)性細(xì)胞緩解疾?。?1－17］。此外，在炎癥環(huán)境中具體是什么因素促進(jìn)了CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，尚需進(jìn)一步的研究證明。本研究中，處于第12天緩解期的CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞同樣不具有調(diào)節(jié)性作用，可能是由于炎癥環(huán)境減輕后，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞受到的刺激作用減弱，調(diào)節(jié)作用不能持續(xù)，這個發(fā)現(xiàn)有待進(jìn)一步驗證。

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞是一群以分泌IL-10為主要特點的免疫功能負(fù)調(diào)性細(xì)胞，它參與調(diào)節(jié)多種自身免疫疾病并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［18－19］。在自身免疫性疾病小鼠模型中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎，清除小鼠體內(nèi)的B細(xì)胞會加重病情，降低自愈傾向［8］。在人外周血中，CD19+CD24hiCD38hi和CD19+CD24hiCD27hiB細(xì)胞亞群被證實具有很強的抑制功能［20－21］。而在小鼠體內(nèi)，調(diào)節(jié)性 B細(xì)胞(Breg)包含在幾乎每一個B細(xì)胞亞群中，比如脾臟的過渡2型 B細(xì)胞(T2-MZP)，邊緣性 B細(xì)胞(MZB)，腹腔淋巴結(jié)中的B-1a型B細(xì)胞等，在小鼠脾臟中，通常用CD19+CD5+CD1dhi表示調(diào)節(jié)性B細(xì)胞［8－9，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥狀態(tài)最為嚴(yán)重的急性期，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞的比例增多，抑制效率增強;而在炎癥消退后，其比例減少，抑制功能也下降到了正常水平。由此可見，CD19+CD5+CD1dhiB細(xì)胞與小鼠腸炎疾病進(jìn)程有著強烈的正相關(guān)性，可能起著與炎性免疫細(xì)胞相互制約的作用，并為IBD的自愈傾向打下了基礎(chǔ)。

本研究證實，抑制炎性因子的分泌可能是調(diào)節(jié)性B細(xì)胞發(fā)揮體內(nèi)免疫抑制作用的方式之一。深入研究其調(diào)節(jié)機制將為自身免疫病的治療提供新的契機。

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