張艷艷，張曉艷，付旭東，劉康棟，趙繼敏，董子明#，張振中

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

紫杉醇(paclitaxel)可促進(jìn)微管蛋白聚合及抑制微管解聚，阻礙細(xì)胞內(nèi)骨架的合成，從而干擾有絲分裂，主要用于治療乳癌、卵巢癌及非小細(xì)胞肺癌、食管癌、膀胱癌等惡性腫瘤[1]。紫杉醇不溶于水，溶解性問(wèn)題是紫杉醇制劑的首要問(wèn)題；且因?yàn)槿狈δ[瘤靶向性，易導(dǎo)致全身毒性。提高紫杉醇的水溶性及增加其治療的靶向性已成為藥理學(xué)家研究的重點(diǎn)。單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNTs)是一種新型的非病毒基因藥物載體，具有獨(dú)特的跨膜能力，能夠被動(dòng)穿過(guò)多種細(xì)胞膜，在藥物、核酸轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值[2-3]，但是其表面高度疏水，不溶于水和有機(jī)溶劑，生物相容性差，故其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。適當(dāng)功能化的SWCNTs能夠承載多種生物分子和藥物進(jìn)入細(xì)胞，且不表現(xiàn)明顯毒性[4-5]。已證實(shí)NGR(N：天冬酰氨酸，G：氨基乙酸，R：精氨酸)是具有腫瘤靶向性的多肽分子，能夠與腫瘤細(xì)胞及新生血管特異性結(jié)合[6]。該研究使用苯丙氨酸等氨基酸對(duì)SWCNTs進(jìn)行表面修飾，將紫杉醇分散吸附到其表面，再與靶向基團(tuán)NGR連接，構(gòu)建了抗腫瘤藥物靶向給藥系統(tǒng)NGR-SWCNTs-Paclitaxel，觀察了該給藥系統(tǒng)對(duì)乳癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用。

1 材料與方法

1.1試劑及細(xì)胞紫杉醇(北京怡禾生物工程有限公司)，SWCNTs(中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所)，NGR(上海吉爾生化有限公司)，泊洛沙姆188(德國(guó)BASF公司)，苯丙氨酸(湖北遠(yuǎn)成股份有限公司)，DSPE-PEG2000-maleimide(DPM)和FITC(美國(guó)Sigma公司)。MCF-7由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院惠贈(zèng)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS)和青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L的RPMI 1640，每2～3 d消化、傳代一次。

1.2NGR-SWCNTs-Paclitaxel復(fù)合物的構(gòu)建稱取處方量的Paclitaxel，加入適量無(wú)水乙醇溶解后，再加入處方量的SWCNTs，在超聲環(huán)境下逐滴加入超純水，離心得到SWCNTs-Paclitaxel復(fù)合物。取SWCNTs-Paclitaxel復(fù)合物2 mL，加入0.2 mg DPM，超聲處理20 min，加入苯丙氨酸和泊洛沙姆188(終質(zhì)量濃度為2.0 g/L)，探頭超聲處理得分散體，100 μm濾膜過(guò)濾，再用超純水重新分散，得到DPM修飾的SWCNTs-Paclitaxel。將NGR加入DPM修飾的SWCNTs-Paclitaxel中，使NGR與DPM的物質(zhì)的量比為151，避光振蕩過(guò)夜，得到NGR-SWCNTs-Paclitaxel，用濾膜過(guò)濾，除去未反應(yīng)完全的NGR。

1.3MCF-7細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確量取NGR-SWCNTs-Paclitaxel或SWCNTs-Paclitaxel分散體溶液5 mL，加入含質(zhì)量濃度為1 kg/L FITC的DMSO溶液1 mL，探頭超聲處理后，靜置24 h，葡聚糖凝膠柱純化，除去未吸附的FITC,得到FITC標(biāo)記的制劑。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，分別用含F(xiàn)ITC標(biāo)記的NGR-SWCNTs-Paclitaxel、SWCNTs-Paclitaxel、Paclitaxel的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組FITC濃度相同，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1、2、4 h后吸去含藥培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞3次，用體積分?jǐn)?shù)75%冰乙醇固定30 min，熒光顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞攝取情況。

1.4NGR-SWCNTs-Paclitaxel對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，96孔板鋪板，使細(xì)胞密度為6×103個(gè)/孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分4組：NGR-SWCNTs-Paclitaxel組、SWCNTs-Paclitaxel組、Paclitaxel組和對(duì)照組，前3組加入相應(yīng)藥物，使Paclitaxel終質(zhì)量濃度為8.0 g/L，對(duì)照組不加藥物。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別于作用24、48和72 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(D)。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值)×100%，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組值均為扣除空白對(duì)照后的值。

1.5NGR-SWCNTs-Paclitaxel對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化后制備混懸液，實(shí)驗(yàn)分組處理方法同1.4，每組復(fù)孔3個(gè)，采用流式細(xì)胞術(shù)PI單染色法分析細(xì)胞周期。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)按照1.4項(xiàng)分組處理細(xì)胞48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC法測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期及凋亡率的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1MCF-7細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光顯微鏡下可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，NGR-SWCNTs-Paclitaxe組細(xì)胞在視野范圍內(nèi)均呈現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光增強(qiáng)。SWCNTs-Paclitaxel也能被細(xì)胞攝取，但熒光強(qiáng)度較弱，用時(shí)較長(zhǎng)。Paclitaxel組細(xì)胞基本無(wú)熒光點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。NGR-SWCNTs-Paclitaxel組抑制效果最強(qiáng)。

2.3細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯鯬aclitaxel可阻止MCF-7細(xì)胞于G2/M期。SWCNTs-Paclitaxel和NGR-SWCNTs-Paclitaxel阻止MCF-7細(xì)胞于G2/M期的作用更強(qiáng)，尤其NGR-SWCNTs-Paclitaxel對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響最明顯。

2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。各組制劑作用MCF-7細(xì)胞48 h后均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡率有所不同，其中NGR-SWCNTs-Paclitaxel誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡效果最顯著。

圖1 MCF-7細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)的熒光顯微鏡圖

A：NGR-SWCNTs-Paclitaxel組; B：SWCNTs-Paclitaxel組; C：Paclitaxel組; D：對(duì)照組。

表1 3組細(xì)胞增殖抑制率的比較 %

*：與Paclitaxel組比較，P<0.05；#：與SWCNTs-Paclitaxel組比較，P<0.05。

表2 4組MCF-7細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果 %

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；△：與Paclitaxel組比較，P<0.05； #：與SWCNTs-Paclitaxel組比較，P<0.05。

表3 4組細(xì)胞凋亡率的比較 %

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；△：與Paclitaxel組比較，P<0.05； #：與SWCNTs-Paclitaxel組比較，P<0.05。

3 討論

紫杉醇是一種傳統(tǒng)的廣譜抗腫瘤藥物，但其溶解度只有0.25 mg/L，這就制約了其在注射給藥方面的應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外市售紫杉醇制劑中除力樸素為脂質(zhì)體外，余均以聚氧乙烯蓖麻油與乙醇作為溶媒，而聚氧乙烯蓖麻油雖能增加紫杉醇的水溶性，但會(huì)引起許多不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)、腎毒性、心血管毒性和神經(jīng)毒性等[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于紫杉醇的研究較集中于開(kāi)發(fā)新型制劑，尋找新的增溶系統(tǒng)和方法，以及提高紫杉醇安全性和腫瘤靶向性。微乳、prodrug、脂質(zhì)體、碳納米管、大分子聚合物、凝膠劑、植入劑、環(huán)糊精包合物等是目前研究較集中的制劑。其中碳納米管以其獨(dú)特的光學(xué)特性、功能化后良好的生物相容性、優(yōu)越的細(xì)胞穿透能力以及能夠改變藥物體內(nèi)分布的特性等特點(diǎn)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

Abraxane是一種注射用紫杉醇白蛋白納米懸乳劑[8]，是紫杉醇新型制劑中較為成功的一例。該蛋白化納米粒不僅能減低溶媒的毒副作用，還可以在快速生長(zhǎng)的腫瘤中蓄積，提高靶向部位濃度，定向釋放給腫瘤細(xì)胞，從而提高藥物療效，是紫杉醇的首個(gè)主動(dòng)靶向制劑，該制劑療效基本是常見(jiàn)的以聚氧乙烯蓖麻油為溶媒制劑的2倍。Potineni 等[9]制備了紫杉醇pH敏感聚氨酯納米粒，該制劑具有較高的載藥量和包封率，能被BT-20細(xì)胞非特異性內(nèi)吞。Yang等[10]在普通紫杉醇脂質(zhì)體表面偶聯(lián)單克隆抗體，脂質(zhì)體能夠與腫瘤細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體HER-2特異性結(jié)合，從而提高了紫杉醇在腫瘤組織和細(xì)胞中的分布。Kam等[11]通過(guò)熒光標(biāo)記觀察到碳納米管可將蛋白質(zhì)攜帶入不同細(xì)胞(懸浮和貼壁細(xì)胞)內(nèi)部。Kam等[12]通過(guò)葉酸化得到磷脂修飾的SWCNTs，并將DNA與SWCNTs結(jié)合，將單義寡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到活細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)脈沖的激光照射，觀察到核苷酸可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。Ladeira等[13]設(shè)計(jì)出一種siRNA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，使siRNA盤(pán)旋于羧基修飾的SWCNTs，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被證明沒(méi)有明顯毒性且轉(zhuǎn)染效率大于95%。

作者以DPM 修飾SWCNTs，再與靶向基團(tuán)NGR連接，制備了NGR-SWCNTs-Paclitaxel復(fù)合物。細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Paclitaxel不能進(jìn)入MCF-7細(xì)胞內(nèi)，而NGR-SWCNTs-Paclitaxel復(fù)合物可被MCF-7細(xì)胞大量快速的攝取。這與Wang等[4]的研究一致。

有文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道紫杉醇能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。該研究結(jié)果表明NGR-SWCNTs-Paclitaxel對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用、G2/M期阻滯效果及其誘導(dǎo)的早期和晚期細(xì)胞凋亡率均明顯高于紫杉醇和SWCNTs-Paclitaxel，這與Frank等[16]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，作者成功構(gòu)建了NGR-SWCNTs-Paclitaxel復(fù)合物，該復(fù)合物具有良好的腫瘤靶向性和優(yōu)于紫杉醇的抗腫瘤效果。今后作者將從分子水平上進(jìn)一步探討紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為新制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

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