張一折，蘆俊萍，張東麗，梁 碩，遲連凱，趙永輝，王滿倉，何 濤，喬露華，田 毅，楊 波，馬 軒，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic membrane derived mesenchymal stem cells，AMSC)是近年來備受關(guān)注的一種新型干細(xì)胞。它具有分離培養(yǎng)容易、增殖快、不受倫理學(xué)限制等優(yōu)越性，同時呈現(xiàn)出低免疫原性與免疫抑制作用，體外誘導(dǎo)可以多向分化，是非常理想的干細(xì)胞來源。Wnt/β-連環(huán)素(β-catenin)信號是調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞譜系分化、神經(jīng)發(fā)育及成體腦中再生神經(jīng)元成熟的重要通路[1-2]，其中β-catenin的表達(dá)水平直接決定神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cell，NPC)的增殖與分化[3]。Wnt屬分泌型糖蛋白，與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，抑制細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β) 活性，引起β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累并進入細(xì)胞核，與淋巴樣增強因子/T細(xì)胞因子(LEF/TCF)結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)相應(yīng)的靶基因c-myc、neurogenins、Neuro D等表達(dá)，從而對細(xì)胞增殖分化進行調(diào)節(jié)。近來研究[4-5]發(fā)現(xiàn)：β-catenin活化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能刺激造血干細(xì)胞的增殖，改善干細(xì)胞微環(huán)境，穩(wěn)定的β-catenin表達(dá)是長期維持造血干細(xì)胞更新的基礎(chǔ)。AMSC具有神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)特性，能向神經(jīng)元定向誘導(dǎo)。然而，β-catenin對AMSC增殖和分化的體內(nèi)外調(diào)控作用尚不清楚。該實驗旨在構(gòu)建介導(dǎo)AMSC β-catenin高表達(dá)的重組腺病毒載體，研究其對AMSC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材料正常足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供)，HEK293細(xì)胞(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院韓圣娜副教授惠贈)，pAd-β-catenin-GFP重組腺病毒(由鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室構(gòu)建并保存)，DMEM/F12培養(yǎng)基(購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，胎牛血清(購自杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(購自Solarbio 公司)，鼠抗β-catenin 單克隆抗體、鼠抗GSK-3β單克隆抗體(均購自Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、蛋白質(zhì)Marker(購自北京鼎國昌盛生物公司)。

1.2人AMSC的分離與培養(yǎng)無菌條件下取正常足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤，鈍性分離胎盤臍帶面的羊膜約10 cm×10 cm，用PBS緩沖液充分沖洗，然后將羊膜盡可能剪碎，加入2.5 g/L的胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，終止消化后將液體倒掉，再以終質(zhì)量濃度為1.0 g/L 膠原酶37 ℃消化90 min。過200目不銹鋼網(wǎng)將消化下來的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1 300 r/min離心8 min收集細(xì)胞，接種于75 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每3～4 d全量換液1次。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分胞體回縮、變圓，即終止消化，然后分為2～3份進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每2～3 d全量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復(fù)上述操作，傳代培養(yǎng)記為P2代，其余類推。取P3代以后細(xì)胞用于實驗操作。

1.3重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒的擴增、純化

HEK293細(xì)胞于75 mL培養(yǎng)瓶生長至豐度為70%左右時，以構(gòu)建好的腺病毒原液5 μL進行感染，以未加腺病毒的正常培養(yǎng)細(xì)胞為對照。培養(yǎng)24 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并于熒光顯微鏡下觀察GFP的熒光現(xiàn)象。

1.4重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒感染AMSC后細(xì)胞生長狀態(tài)的測定AMSC鋪滿瓶底70%左右時，向75 mL培養(yǎng)瓶中加入100 μL腺病毒懸液，輕輕晃動瓶子，使混勻。以未加腺病毒的正常培養(yǎng)細(xì)胞作對照。感染24 h后，接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)3個復(fù)孔，接種后24 h采用CKK-8法測板，連測5 d。測定前每孔加入10 μL CKK-8溶液于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長讀取吸光度值(A)并計算重組腺病毒穩(wěn)定表達(dá)的AMSCs的增殖率。增殖率=(腺病毒感染組A值/對照組A值-1)×100%。

2 結(jié)果

2.1重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒的擴增重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象，主要變化為細(xì)胞偽足縮短、變圓、有部分細(xì)胞脫落，與對照組細(xì)胞形態(tài)明顯不同(圖1A和B)。同時熒光顯微鏡下能看到熒光現(xiàn)象(圖1C)。重組腺病毒在HEK293細(xì)胞中得以大量擴增。

圖1 HEK293細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.2AMSCs中β-catenin表達(dá)的熒光檢測結(jié)果GFP標(biāo)記的含β-catenin的重組腺病毒感染AMSC 48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)感染組細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比沒有明顯的形態(tài)變化，但數(shù)量上稍有增加(圖2A和B)，在熒光顯微鏡下能看到大量的熒光現(xiàn)象(圖2C)。

圖2 AMSC形態(tài)(×100)

2.3重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒感染AMSC后細(xì)胞生長狀況的測定結(jié)果結(jié)果顯示,第1～5天，β-catenin穩(wěn)定高表達(dá)的AMSCs增殖率分別為50.0%、82.5%、92.6%、169.1%和128.2%，明顯高于正常的AMSCs，說明高表達(dá)的β-catenin能有效地刺激AMSCs的增殖。

3 討論

β-catenin在胞質(zhì)中的含量升高積累，促使它可以進一步移位至細(xì)胞核內(nèi)與T細(xì)胞因子形成復(fù)合物，從而激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞生長；另外，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)可與鈣粘素和細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合維持其穩(wěn)定性，β-catenin的表達(dá)水平?jīng)Q定神經(jīng)系統(tǒng)中NPC和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)的增殖與分化[6]。

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化以及胚胎干細(xì)胞的早期增殖與Wnt 信號通路有關(guān)[7]，而關(guān)于AMSC增殖、分化調(diào)控的明確機制無相關(guān)文獻(xiàn)報道。

β-catenin作為Wnt 信號途徑的關(guān)鍵成員，通過正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)干細(xì)胞的數(shù)量，在內(nèi)外因素中都發(fā)揮著重要的作用[8-9]。細(xì)胞內(nèi)游離β-catenin在沒有Wnt 信號刺激的情況下很容易被胞內(nèi)降解系統(tǒng)所降解，極不穩(wěn)定，細(xì)胞中僅有少量的β-catenin以保證正常細(xì)胞的生理生化功能，不至于成瘤化[10]，所以引入外源的β-catenin或阻礙胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的磷酸化與降解，都可以進一步促使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的積累，達(dá)到一定量后進入細(xì)胞核。從某種程度上來說β-catenin的入核意味著Wnt/β-catenin信號通路的激活。β-catenin作為把核外信號傳遞到核內(nèi)的信號蛋白，在Wnt信號通路中處于關(guān)鍵地位，該蛋白的表達(dá)水平直接影響Wnt信號通路的生物學(xué)效應(yīng)。

GFP能夠在紫外線的激發(fā)下發(fā)出明亮的綠色熒光[11]，被認(rèn)為是一種理想的報道基因，是研究細(xì)胞基因表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物分布的最好工具[12]。作者將GFP基因融合在β-catenin基因的5’端，既保留了β-catenin的轉(zhuǎn)錄激活功能，又能通過GFP直接觀察β-catenin在活細(xì)胞內(nèi)的分布和表達(dá)。

腺病毒載體能夠感染多種哺乳動物細(xì)胞，宿主范圍廣，包裝容量大，對人致病性低，攜帶的外源基因在靶細(xì)胞內(nèi)以附加體形式存在，并不整合到宿主染色體中，具有極低的插入突變危險性和較低的遺傳毒性；轉(zhuǎn)移效率高，容量大，無需輔助病毒，可插入外源基因的片段達(dá)7～8 kb；對于細(xì)胞是否處于分裂期無嚴(yán)格要求，能夠在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因；同時制備簡單，可以通過超離心得到高滴度的病毒[13]。

該研究通過建立GFP標(biāo)記、重組腺病毒載體介導(dǎo)β-catenin高表達(dá)的AMSC和體外調(diào)控β-catenin的表達(dá)，研究了經(jīng)典Wnt信號通路中的β-catenin對AMSC增殖的影響。通過熒光顯微鏡檢測顯示pAd-β-catenin-GFP重組腺病毒感染AMSC后，外源β-catenin于AMSC中成功表達(dá)，且外源β-catenin對AMSC的增殖有促進作用，明顯高于對照組。

總之，該研究為了解β-catenin在AMSC細(xì)胞增殖和分化中的調(diào)節(jié)作用提供了實驗支持，并為優(yōu)化AMSC在中樞神經(jīng)性疾病中的臨床治療效果奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。

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