方 華，謝全靈，黃曉燕，晉文慧，張怡評，洪 專

(國家海洋局 第三海洋研究所，福建 廈門 361005)

4-氨基吡啶(4-AP)能促使中樞乙酰膽堿酶從神經(jīng)末段釋放，它具有收縮血管、提高血壓、刺激呼吸和加快心率的作用，可能成為拮抗海洋生物毒素TTX中毒的解毒劑[1-8]. 為增強4-AP對TTX解毒作用的生物活性，降低大劑量4-AP對機體正常細(xì)胞造成的損傷，合成了一系列4-AP衍生物，經(jīng)小鼠體外活性測試，發(fā)現(xiàn)所合成的磷?；彼?4-氨基吡啶衍生物能大幅提升TTX中毒小鼠的存活時間，具有開發(fā)成為新型TTX解毒藥物的潛力. ESI-MSn可以選擇性對某一碎片離子進行進一步的分析，多級質(zhì)譜分析是鑒定化合物結(jié)構(gòu)的一種十分重要的方法，它可以確認(rèn)母離子和子離子之間的歸屬. ESI-MS廣泛用于化合物碎片解析和機理研究[9-12]. 為了進一步開展4-AP類衍生物在小鼠體內(nèi)的藥物代謝機理研究，本文作者進行了ESI-MS/MS法研究4-AP衍生物在生理鹽水條件下的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，提出這些化合物的裂解途徑，對離子重排峰m/z= 95，推測了其重排的機理.

1 試驗部分

1.1 儀器與裝置

Bruker Esquire-3000電噴霧離子阱多級質(zhì)譜儀：德國布魯克道爾頓公司產(chǎn)品，檢測范圍至m/z6 000，Cole-Parmer Model 74900 syringe pump進樣泵，美國Cole-Parmer 公司產(chǎn)品.

1.2 主要試劑

根據(jù)文獻[13-15]方法合成一系列N-二異丙基磷?；被?N-4-氨基吡啶的化合物(C1-C6)，合成路線如圖1所示，產(chǎn)物經(jīng)核磁、紅外、高分辨質(zhì)譜鑒定. 實驗用水為Millipore純水機生產(chǎn)的超純水.

CompoundsR1R2CompoundsR1R2C1-CH3-HC2-CH2Ph-HC3-CH(CH3)CH2CH3-HC4-CH2CH(CH3)2-HC5-CH(CH3)2-HC6-CH3-Cl

圖1化合物C1-C6的合成路線
Fig.1 Synthetic pathway of compoundsC1-C6

1.3 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源：噴霧電壓4 000 V，毛細(xì)管溫度300 ℃；噴霧氣(N2)壓力：7 psi；干燥氣(N2)流速：4 L·min-1；進樣速度4 μL·min-1. 取適量樣品溶于生理鹽水中，采用直接進樣法進行點噴霧質(zhì)譜研究.

2 結(jié)果與討論

表1列出化合物C1-C5加氫離子的電噴霧多級質(zhì)譜碎片離子及相對豐度. 從表1可以看出，對化合物C1-C5加氫母離子進行電子轟擊時，可以得到以下主要的碎片離子：a離子[m-42]+、b離子[m-122]+、c離子[m-164]+、d離子[m-206]+和e 離子m/z= 95. a碎片是母離子在電子的轟擊作用下失去一分子丙烯得到[m-C3H6]+的離子峰，b碎片是C-C (與羰基相連的碳原子)鍵發(fā)生斷裂而失去一分子吡啶甲酰胺分子后得到的離子峰 [m-NC5H4NHCHO]+. 為了進一步分析c碎片的分子結(jié)構(gòu)，有必要對二級離子碎片作第三級電子轟擊. 以化合物C4為例說明此4-AP衍生物化合物的裂解規(guī)律. 對C4的分子離子峰m/z= 372作二級質(zhì)譜轟擊得到m/z= 330 (a離子[m-42]+)，250 (b離子[m-122]+)，208 (c離子[m-164]+)和166 (d離子[m-206]+)的碎片離子峰，a離子m/z= 330是母離子失去一分子丙烯的碎片峰，對它作三級質(zhì)譜轟擊得到的是再失去一分子單異丙基亞磷酸酯片段的c碎片離子m/z= 208 (如圖2所示)，同時，b離子m/z= 250是母離子失去一分子吡啶甲酰胺分子的碎片峰，對它作三級質(zhì)譜轟擊將得到接連失去兩分子丙烯的c′ 碎片離子m/z= 208和d碎片離子m/z= 166.

碰巧的是c和c′的碎片離子都是m/z= 208，為了證實它們所對應(yīng)的離子結(jié)構(gòu)完全不一樣，在4-AP的芳香環(huán)上引入一個氯原子取代基合成了4-AP衍生物C6化合物. 對C6的分子離子峰m/z= 364作二級質(zhì)譜轟擊得到m/z= 322 ( [m-C3H6]+)，280 ([m- C6H12]+)，200 ([m-C6H13O3P]+)，129 (2-氯-4-氨基吡啶加氫碎片離子)，208 ([m-C6H5ClN2O]+)，166 ([m-C9H11ClN2O]+)和124 ([m-C12H17ClN2O]+). 離子m/z= 322是母離子失去一分子丙烯的碎片峰，而離子m/z= 280是母離子同時失去兩分子丙烯的碎片峰，離子m/z= 200是母離子失去一分子二異丙基亞磷酸酯(DiPP)后的碎片離子峰，離子m/z=129是2-氯-4-氨基吡啶加氫碎片離子(如圖3所示). 同時，母離子也可以從另一邊的鍵斷裂，離子m/z= 208是母離子失去一分子2-氯吡啶甲酰胺分子的碎片峰，對它做三級質(zhì)譜轟擊將得到接連失去兩分子丙烯的碎片離子m/z= 166和d碎片離子m/z= 124.

表1 化合物C1-C5加氫離子的電噴霧多級質(zhì)譜碎片離子及豐度(%)Table 1 ESI-MS/MS of [M+H]+ ions and abundance (%) of compounds C1-C5

圖2 化合物C4的 [M+H]+ 離子的多級質(zhì)譜ESI-MS/MS裂解規(guī)律Fig.2 Fragmentation pattern obtained from the product ion scan of the protonated molecules from compounds C4

e′碎片離子m/z= 95是一個離子重排峰，其離子形成的可能機理如圖4所示. 我們推測其重排的機理如下，首先，與N相連的C原子上的H通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移進攻磷?；系腛原子，同時碳負(fù)離子與磷正離子形成P-C鍵，得到三圓環(huán)氮鎓的中間過渡態(tài)，此過渡態(tài)很不穩(wěn)定，P-N鍵易斷裂，形成亞胺離子，亞胺離子的雙鍵打開與磷羥基形成C-O鍵，同時失去氨基酸側(cè)鏈與氮原子組成的三元環(huán)分子，得到m/z= 95的碎片離子峰，由于此離子含有磷?；匈|(zhì)譜增敏效應(yīng)，所以在多級質(zhì)譜圖中表現(xiàn)出的是基峰[16-20].

圖3 化合物C6加氫的二級質(zhì)譜圖Fig.3 ESI-MS/MS of the protonated adducts of compound C6

圖4 化合物C1-C5的e′碎片離子m/z = 95形成的可能機理Fig.4 Possible rearrangement mechanism for the product ion e′ m/z = 95 from compounds C1-C5

參考文獻：

[1] BENTON B J, KELLER S A, SPRIGGS D L, et al. Recovery from the lethal effects of saxitoxin: a therapeutic window for 4-aminopyridine (4-AP)[J]. Toxicon, 1998, 36(4): 571-588.

[2] CHANG F T C, SPRIGGS D L, BENTON B J, et al. 4-Aminopyridine reverses saxitoxin (STX)- and tetrodotoxin (TTX)-induced cardiorespiratory depression in chronically instrumented guinea pigs[J]. Fund Appl Toxico, 1997, 38(1): 75-88.

[3] BERG T. The vascular response to the K+channel inhibitor 4-aminopyridine in hypertensive rats [J]. Eur J Pharmacol, 2003, 466 (2): 301-310.

[4] 方 華，陳偉珠，洪碧紅, 等. N-二異丙基磷?；被?N-4-氨基吡啶衍生物的合成及對TTX解毒生物活性的研究[J]. 有機化學(xué), 2012, 32(1): 178-182.

[5] 郭洪聲, 何錫文, 景 瑩, 等. 4-氨基吡啶分子模板聚合物選擇性識別及結(jié)合性質(zhì)的研究[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2001, 22 (5): 739-743.

[6] 宋紹麗, 魏春玲, 古華光, 等. 4-氨基吡啶敏感鉀通道對神經(jīng)自發(fā)放電節(jié)律轉(zhuǎn)遷歷程的調(diào)節(jié)作用[J]. 生理學(xué)報, 2010, 62 (1): 35-41.

[7] MICHAEL M, PAUL W D, WOLF-RUDIGER S. Ionic mechanism of 4-aminopyridine action on leech neuropile glial cells[J]. Brain Research, 1999, 826(1): 63-73.

[8] 劉先勝, 徐永健, 張珍祥, 等. 鉀通道阻滯劑對大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2003, 38(5): 333-336.

[9] CHEN Jing, JIANG Yang, FU Hua, et al. Rearrangement with formamide extrusion in the electrospray mass spectra of aminoacylbenzylamines[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2001, 15: 1489-1493.

[10] 葉 勇, 曹立峰, 牛明玉, 等. 三聚吡咯絲組綴合物的電噴霧電離質(zhì)譜裂解規(guī)律研究[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2006, 27(4): 203-208.

[11] 董 宇, 仇 峰, 張玉峰, 等. 氨基甲酸酯類化合物電噴霧多級質(zhì)譜分析中一種特殊的中性丟失CO2的重排反應(yīng)[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2005, 26(1): 6-9.

[12] 葉 勇，馬利波，梁顏紅, 等. 3-(O-甲基-O-烷基磷?；?丙酰胺的電噴霧質(zhì)譜裂解方式研究[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2008, 29(3): 143-146.

[13] 李光毅. 三苯基膦和六氯乙烷肽偶聯(lián)試劑的中間體研究[J]. 三明學(xué)院學(xué)報, 2010, 27(2): 169-172.

[14] 傅玉琴, 范雪娥, 黃華鳴, 等.α-羥基-雜(芳)環(huán)取代甲基膦酸二乙酯的合成及晶體結(jié)構(gòu)[J]. 化學(xué)試劑, 2008, 30(1): 1-4.

[15] ISABELLE M L, SLAYTON A E J. Studies toward the asymmetric synthesis ofγ-amino phosphonic acids via the addition of phosphites to enantiopure sulfinimines[J]. J Org Chem, 1997, 62: 7532-7533.

[16] CHEN Jing, CHEN Yi, NIU Yan Lin, et al. A carbonyl oxygen migration in electrospray ionization mass spectrometry and its application in differentiatingαandβ-alanyl peptides [J]. J Mass Spectrom, 2002, 37: 934-939.

[17] EDYTA P, PAWEK, LEONARD M P, et al. Effect of an aliphatic spacer group on the adsorption mechanism on the colloidal silver surface ofL-proline phosphonodipeptides[J]. J Raman Spectroscopy, 2008, 39(12): 1726-1739.

[18] MEEHIR P, MALLARD W G, IMSUK Y. Microsynthesis and mass spectral study of chemical weapons convention related 2-alkyl-1, 3, 6, 2-dioxathiaphosphocane-2-oxides[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22: 1971-1980.

[19] ALEXANDER B, ZHANG X M, KOEN A, et al. Structure-activity relationship of diaryl phosphonate esters as potentirreversible dipeptidyl peptidase IV inhibitors[J]. J Med Chem, 1999, 42: 1041-1052.

[20] JU Zhi Yu, YE Yong, ZHONG Shang Bin, et al. A novel rearrangement in ESI-MSnof spirocyclic pentaerythritol di(phosphate monoamides)[J]. Inter J Mass Spectrom, 2008, 273: 31-34.