李國民 沈 茜 徐 虹 安 宇

腎病綜合征(NS)是因腎小球濾過屏障受損而引起的一組臨床綜合征。腎小球濾過屏障由內(nèi)皮細胞、基底膜和足細胞構(gòu)成。多項研究表明，足細胞在腎小球濾過屏障中起關(guān)鍵作用，特別是足細胞相鄰足突構(gòu)成的裂隙膜(slit diaphragm，SD)［1～4］。依據(jù)對激素治療的反應可將 NS 分為激素敏感型(SSNS)和激素耐藥型 (SRNS)［5］。10%～20%的NS患兒為SRNS，超過半數(shù)的SRNS患兒在10年內(nèi)會進展為終末期腎病(ESRD)［5～7］。在 NS患者中，有一類是由足細胞和基底膜相關(guān)分子基因突變所引起，該類NS又稱為遺傳性NS［8，9］。遺傳性NS患者不僅表現(xiàn)對激素耐藥，對其他免疫抑制劑幾乎均耐藥，屬于SRNS范疇，治療的主要方向是減輕蛋白尿和保護腎功能，延緩疾病進展;這類SRNS患者易快速進展為ESRD，而進展為ESRD后的最佳治療選擇為腎移植，因為遺傳性NS患者腎移植后復發(fā)率很低［10～13］。目前臨床觀點認為，在SRNS患者選擇免疫抑制劑治療和終末期腎移植之前應將遺傳性NS患者篩選出來，其目的是為SRNS患者提供個體化治療，避免盲目治療［14～17］。本文就SRNS相關(guān)致病基因、主要基因突變流行率，及臨床基因分析對象、方法和意義進行綜述。

1 SRNS的定義和分類

兒童SRNS診斷標準:潑尼松1.5～2.0 mg·kg-1·d-1(最大不超過60 mg)治療4～8周，或相應劑量的其他類型的腎上腺皮質(zhì)激素治療4～8周，尿蛋白不能轉(zhuǎn)陰［18，19］。依據(jù)SRNS患者是否伴有腎外癥狀，可將 SRNS分為非綜合征型(單發(fā)型)SRNS 和綜合征型 SRNS［8，14］。非綜合征型SRNS只有NS表現(xiàn)，不伴有其他系統(tǒng)癥狀，綜合征型SRNS不僅有NS的表現(xiàn)，還有先天性或遺傳性疾病引起的腎外癥狀;依據(jù)發(fā)病年齡又可以將SRNS分為先天性(0～3個月)、嬰兒型(～12個月)、兒童早發(fā)型(～5歲)、兒童遲發(fā)型(～13歲)、青少年型(～18歲)和成人型(＞18 歲)［8，14］;依據(jù)患者間是否具有血緣關(guān)系，SRNS 可分為家族性和散發(fā)性。

表1 非綜合征型SRNS及其致病基因

2 SRNS的相關(guān)致病基因

SRNS患者發(fā)病早，有腎病水平蛋白尿家族史，快速進展為 E SRD 提 示由遺傳因素引起［14，15，20］。1998 年，發(fā)現(xiàn)了NPHS1，其編碼nephrin是足細胞SD結(jié)構(gòu)構(gòu)成和信號傳導分子，是維持腎小球濾過屏障完整性的關(guān)鍵分子之一，也是芬蘭型先天性NS主要致病基因［21］。NPHS1的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了NS致病基因和分子研究時代。

2.1 非綜合征型(單發(fā)型)SRNS致病基因 目前有12種基因突變可分別引發(fā)非綜合征型SRNS(表1)，其臨床主要病理類型為局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)、彌漫系膜硬化(DMS)和膜增生性腎小球腎炎(MPGN)。這些基因產(chǎn)物均在腎小球足細胞中表達，有的分子直接、間 接 參 與 SD(NPHS1、NPHS2、CD2AP)和肌動蛋白細胞骨架(ACTN4、INF2)的構(gòu)成，有的參與細胞代謝和信號轉(zhuǎn)導(PTPRO、 PLCE1、 APLO1、MYO1E、DGKN 和 ARHGDIA)［20～32］。 N PHS1、 N PHS2、PTPRO、PLCE1、CD2AP、APLO1、MYO1E、DGKN 和 A RHGDIA引起的SRNS表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳(AR)，在兒童時期發(fā)病(APLO1除外，其突變主要在成年期發(fā)病);而ACTN4、TRPC6和INF2引起的SRNS表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳(AD)，多數(shù)患者在青少年或成年期發(fā)病［12，14，34］。APLO1與成人ESRD、FSGS和非糖尿病腎病發(fā)病有關(guān)，這些疾病主要發(fā)生在非裔美國人群中，未見其在其他人群中發(fā)生，表明APLO1所致疾病與種族有關(guān)聯(lián)［29，35，36］。這些基因突變類型有錯義、無義突變、插入、缺失和剪切突變等，其中錯義突變是主要突變類型，可以累及基因所有編碼區(qū)，故無熱點突變［14，15，37］。

2.2 綜合征型SRNS致病基因綜合征型SRNS患者腎外癥狀明顯，經(jīng)常因腎外癥狀就診，后發(fā)現(xiàn)腎臟表現(xiàn)。引起綜合征型SRNS的基因見表2，這些基因不僅僅在足細胞中表達，而且在其他組織和細胞也有表達。其中WT1和LMX1B編碼的蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子，LAMB2和ITGB4編碼的蛋白屬于腎小球基底膜構(gòu)成分子，SCARB2編碼的蛋白屬于溶 酶 體 蛋 白 ，COQ2、PDSS2、COQ6和MTTL1編碼的蛋白屬于線粒體蛋白，SMARCAL1編碼的蛋白屬于DNA核小體重組調(diào)節(jié)因 子［37～52］。WT1、LAMB2 和MYH 9突變可僅有SRNS表現(xiàn)(非綜合征型)，也可引起相應的綜合征同時伴發(fā)SRNS(綜合征型)［40，54，55］。WT1、MYH9、ITGB4、ZMPSTE24 和 LMNA突變可以引發(fā)多個臨床綜合征，并不是都伴有SRNS，僅部分伴有SRNS(表2)。如WT1突變可以引起中疾病，Denys-Drash綜合征和Frasier綜合征可伴有NS表現(xiàn)，而體細胞間皮瘤和Wilms腫瘤1型無NS表現(xiàn)。此外，WT1突變也可僅有NS表現(xiàn)，所以有時 WT1可用 NPHS4作為基因代碼［54，56，57］。Galloway-Mowat綜合征于1968首次描述，臨床表現(xiàn)為早期發(fā)病的NS(病理DMS)、小頭畸形和裂孔疝，為AR，至今尚未發(fā)現(xiàn)其致病基因［58］。

3 SRNS相關(guān)致病基因的突變頻率

澳大利亞的研究發(fā)現(xiàn)，SRNS是兒童繼先天性腎臟泌尿道畸形(CAKUT)之后第二常見的遺傳性腎臟疾?。?9］。在綜合征型SRNS致病基因中，WT1是所致疾病相對常見的基因，其他基因所致疾病比較罕見［38］。在非綜合征型SRNS致病基因中，PTPRO所致疾病不太常見，可能與相關(guān)研究不夠有關(guān)［15］。國外研究顯示，相對常見的SRNS相關(guān)致病基因在不同人群的流行率是不同的(表3)［9，12，14，60～68］。國 內(nèi) 對 SRNS 致 病 基 因 研 究 比 較 少，NPSH2在散發(fā)性SRNS患兒中的突變率為4%～5%［69］，WT1在3歲之前散發(fā)性SRNS患兒中的突變率為16%～17%，3歲之后未見報道［70］。NPHS1在散發(fā)性SRNS患兒中的突變率為4.5%［71］。世界各地研究發(fā)現(xiàn)，某一基因的突變率并不一致，可能是種族的影響?？傮w特征是，年齡越小發(fā)病的 SRNS，基因所致可能性越大［15，72～74］。

表310個相對常見SRNS基因的突變率(%)

4 SRNS相關(guān)致病基因分析對象和策略

4.1 分析對象 從SRNS相關(guān)致病基因在不同人群中流行特點來分析，兒童是基因分析的主要對象，無論是散發(fā)性還是家族性 S RNS 均應該進行相關(guān)基因分析［14，15，60］。NPHS2、ACTN4、TRPC6和INF2在家族性SRNS成人病例中有一定的突變率，但在散發(fā)性SRNS成人中罕見，因此家族性AR的 SRNS患者可行 NPSH2分析，AD患者可行ACTN4、TRPC6和INF2分析，散發(fā)性SRNS成人病例可不行基因分析［9，16，34］。

4.2 分析方法 目前，SRNS相關(guān)致病基因分析方法主要是用Sanger法對外顯子及附近區(qū)域直接測序，并已經(jīng)從實驗室走向臨床［14，15，60］。這種方法的優(yōu)點是準確性高、重復性強，缺點是需要消耗大量的財力和時間，這也限制了SRNS相關(guān)致病基因分析在臨床推廣。對于有熱點突變的基因，基于SnapShot等技術(shù)的熱點突變分析是目前臨床經(jīng)濟、有效和快速的基因分析方法。隨著科技的發(fā)展，高通量測序儀已在生物科學領(lǐng)域應用。基于芯片技術(shù)的多基因外顯子捕獲和高通量測序?qū)⑹俏磥鞸RNS相關(guān)致病基因全面分析的方向［75］。

4.3 分析策略 涉及SRNS發(fā)病基因達到數(shù)十個，臨床對所有SRNS致病基因進行分析無疑是很昂貴和耗時、也不切實際。臨床理想的SRNS致病基因分析策略是根據(jù)表型與基因型的對應關(guān)系，有針對性的進行某些基因分析，但SRNS患兒表型與基因型具有異質(zhì)性，非對應關(guān)系，這就給臨床SRNS患者基因分析帶來困難。對于綜合征型SRNS患兒，致病基因分析的策略是根據(jù)腎外表現(xiàn)來推斷可能的致病基因，然后對該基因進行直接測序(圖1)［9，11，20，42，46，60，76］。而對于非綜合征 S RNS 患兒，目前臨床策略是對非綜合征SRNS患兒先行腎活檢，依據(jù)病理表型來推斷可能的致病基因，然后進行候選致病基因直接測序(圖 2 )［8，15，16，60，77］，這樣可盡可能縮小檢測基因范圍。但近年來有學者認為，SRNS患兒致病基因分析應該先于腎活檢，其理由為腎活檢具有創(chuàng)傷性，腎臟病理類型與致病基因并沒有直接的關(guān)系。盡管多數(shù)SRNS患兒主要腎臟病理為FSGS和DMS。但研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性SRNS患兒的早期腎臟病理改變可為輕微病變(MCD)或系膜增殖性腎小球腎炎(MsPGN)，晚期可以表現(xiàn)為FSGS或DMS，并無特征性改變［14，15］。由于1歲以內(nèi)兒童 N S主要由 N PHS1、NPHS2 和WT1等基因突變引起，特別是先天性腎病綜合征(CNS)［74，78］。因此，對 C NS 和嬰兒型 N S 患兒應常規(guī)行NPHS1、NPHS2和 WT1等基因分析，更應該先于腎活檢［8，15，60，78］。合理的兒童 S RNS 相關(guān)致病基因臨床分析策略應該是根據(jù)特定SRNS兒童人群(遺傳背景相似)的突變圖譜來選擇致病基因分析。這就需要通過對特定SRNS兒童人群進行致病基因研究，建立該人群SRNS致病基因突變圖譜。成人主要依據(jù)是家族性或散發(fā)性來決定基因分析策略，如是家族性，遺傳方式為 A D，可考慮行 A CTN4、TRPC6和INF2分析;遺傳方式為AR，可行NPHS2分析。如果是散發(fā)性，可以不用進行基因分析，或行 N PHS2 Q229R位點分析，如果存在NPHS2 Q229R，可考慮進行全NPHS2 基因分析［12，14，16，79］。

圖1 綜合征型SRNS基因檢測流程圖

圖2 非綜合征型SRNS基因檢測流程圖

5 SRNS相關(guān)致病基因臨床分析的意義

SRNS 發(fā)病機制和治療一直困擾著兒科臨床醫(yī)生或腎臟病工作者。SRNS致病基因不僅能明確患者的病因和發(fā)病機制，而且可以指導治療。指導治療體現(xiàn)在不必要使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，進入ESRD的SRNS患者優(yōu)先考慮腎移植治療［15，80，81］。SRNS致病基因分析是臨床提供遺傳咨詢的依據(jù)，這種遺傳咨詢不僅可以提供給患者的父母，同時也可提供給患者本人［8，77］。如父母是NPHS1突變的攜帶者，其子女發(fā)生CNS的概率為25%，母親在妊娠20周后應該檢測α甲胎蛋白(AFP)，AFP顯著增高提示CNS可能性極大，必要時可行產(chǎn)前診斷;又如 W T1突變的患者，理論上有發(fā)生Wilm's腫瘤和腎胚胎瘤的可能，應該定期隨訪腎臟超聲［11，37，77］。

總之，SRNS致病基因多種，SRNS患者的表型和基因型復雜。臨床工作者應該首先在不同遺傳背景人群構(gòu)建SRNS基因突變圖譜，根據(jù)圖譜再構(gòu)建基因分析的方案，然后依據(jù)方案選擇經(jīng)濟、快速和準確的方法來分析SRNS致病基因。雖然基于芯片技術(shù)的多基因外顯子捕獲和高通量測序?qū)⑹俏磥鞸RNS相關(guān)致病基因全面分析的方向，這些技術(shù)已經(jīng)不是問題，但是龐大的測序數(shù)據(jù)分析將成為這項技術(shù)開展的新問題。集數(shù)學、生物學和計算機學為一體的生物信息學發(fā)展會幫助解決這些新問題。

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