李曉沖，張秀英，徐 尚，李 宏，張燕華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的發(fā)病率逐年上升。非酒精性脂肪性肝?。╪on－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括：?jiǎn)渭冃灾咀冃?、脂肪性肝炎和肝硬?個(gè)病理階段。脂肪性肝炎為預(yù)后較差的一個(gè)階段，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌［1］，目前尚無(wú)明顯有效的治療方法。動(dòng)物模型在探索疾病的發(fā)病機(jī)制、評(píng)價(jià)診斷方法、篩選防治藥物等領(lǐng)域均有重要作用。近年來(lái)，許多學(xué)者利用試驗(yàn)動(dòng)物復(fù)制非酒精性脂肪肝病理模型并對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，取得了許多成果。其中C57BL/6J小鼠對(duì)高脂較敏感，是理想的建模動(dòng)物。本試驗(yàn)采用高脂飼料和高脂與四氯化碳聯(lián)合誘導(dǎo)，并比較了兩種誘導(dǎo)方法以及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)非酒精性脂肪肝的變化與進(jìn)程的影響，目的是探索建立較理想動(dòng)物模型的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 近交系 C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，9～10周齡，共60只，雄性。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk黑2006－009。

1.1.2 藥物與試劑 所用藥品為分析純由天津虔誠(chéng)偉業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，生化試劑盒由南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司提供，油紅O試劑由Sigma公司提供。

1.1.3 儀器 RM2135切片機(jī)，冷凍切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），英諾華自動(dòng)生化儀。

1.2 方法

1.2.1 高脂飼料制備 高脂飼料：15%豬油，1%膽固醇，0.5%膽鹽，15%糊精，68.5%基礎(chǔ)飼料。豬油是由市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的經(jīng)檢驗(yàn)合格的動(dòng)物脂肪熬制所得。

1.2.2 分組與模型建立 小鼠按隨機(jī)原則分為正常組、高脂組和高脂復(fù)合四氯化碳組（復(fù)合組），每組20只。所有動(dòng)物適應(yīng)飼喂1周后，正常組飼喂普通飼料，高脂組飼喂高脂飼料，復(fù)合組除飼喂高脂飼料外，首次每只小鼠以0.72mL/100g劑量皮下注射CCl4溶液，以后每周1次以0.42mL/100g劑量皮下注射40%的CCl4－植物油（V/V）溶液，連續(xù)3周。各組分別于第4、6、8周，取5只小鼠進(jìn)行稱(chēng)重剖殺，取血分離血清，剖檢，取肝臟稱(chēng)濕重；取肝組織固定，分別進(jìn)行H.E.染色和油紅O染色，做病理學(xué)檢查。

1.2.3 觀察指標(biāo)和測(cè)定方法 一般檢查：試驗(yàn)期間每周稱(chēng)小鼠體量1次，并觀察其毛色、食欲、行動(dòng)、對(duì)外界刺激的反應(yīng)情況；病理組織學(xué)檢查：肉眼觀察小鼠肝臟大體變化，采用H.E.染色和油紅O染色，光鏡下觀察小鼠肝臟病變；血液生化指標(biāo)的檢測(cè)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（T－CHO）等血液生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化儀分析。

1.2.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 判斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)中華肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》（2010年修訂版）［2］。計(jì)量資料用X±S表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，用SAS9.1軟件統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般指標(biāo) 試驗(yàn)過(guò)程中，與對(duì)照組小鼠相比，高脂組和復(fù)合組小鼠毛發(fā)油膩、凌亂。食量減少，對(duì)外界刺激的反應(yīng)較遲鈍。與對(duì)照組小鼠相比，高脂組和復(fù)合組小鼠體重均呈下降趨勢(shì)，且差異極顯著（P＜0.01）；肝指數(shù)上升，第4周差異顯著，6～8周差異極顯著（P＜0.01）。復(fù)合組與高脂組相比，第8周肝指數(shù)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 小鼠體重、肝重和肝指數(shù)比較

2.2 病理學(xué)變化 肉眼觀察，8周時(shí)，正常組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性；高脂組與復(fù)合組小鼠肝臟腫大易碎、包膜稍緊張、邊緣圓鈍、呈棕黃色、切面有油膩感，且膽囊變色。結(jié)果如中插彩版圖1所示。光鏡下，正常組小鼠肝細(xì)胞正常，肝索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。高脂組4周，脂肪變性的肝細(xì)胞占2/3以上，呈魚(yú)網(wǎng)狀，8周可見(jiàn)氣泡樣變與凋亡的肝細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。復(fù)合組4周時(shí)，脂肪變性的肝細(xì)胞占2/3以上，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。8周時(shí)，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)灶，出現(xiàn)纖維化和大量氣泡樣變的肝細(xì)胞。油紅O染色可見(jiàn)，8周時(shí)高脂組比復(fù)合組小鼠肝臟的橘紅色脂滴廣泛，復(fù)合組中肝臟的肝竇擴(kuò)張。見(jiàn)中插彩版圖2～9。

2.3 血液生化指標(biāo) 4周時(shí)，高脂組和復(fù)合組血清中TG和T－CHO水平均顯著高于對(duì)照組。8周時(shí)高脂組TG含量又顯著高于復(fù)合組（P＜0.05）。4周時(shí)，高脂組和復(fù)合組小鼠血清中的轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，其中GPT水平均顯著高于對(duì)照組，且保持較平穩(wěn)的高水平。復(fù)合組中GOT、GGT水平與高脂組也有顯著差異（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 小鼠血清中 GPT、GOT、GGT、TG和T－CHO比較

3 討論

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是指除過(guò)量飲酒和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)量沉積，是一類(lèi)獲得性的代謝應(yīng)激相關(guān)性肝病。為深入研究非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制，建立一個(gè)與人類(lèi)病變相似的動(dòng)物模型極為重要。目前國(guó)內(nèi)外主要采用高脂飼喂Wistar或SD大鼠，或是膽堿－蛋氨酸缺乏飲食（MCD）C57BL/6J小鼠模型。前者炎癥的產(chǎn)生和造模時(shí)間較長(zhǎng)，后者可以較快復(fù)制模型，但模型中血清TG和肝指數(shù)下降，且由于缺少膽堿和蛋氨酸成分，不符合人類(lèi)實(shí)際的飲食情況［3－4］。人類(lèi)生活中高脂飲食是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝主要因素，而使用的一些藥物或是攝入的毒性物質(zhì)也在損傷肝臟［5］。本試驗(yàn)采用高脂飲食和復(fù)合誘導(dǎo)兩種造模方法。

試驗(yàn)中高脂組和復(fù)合組肝指數(shù)顯著高于正常組?？紤]到高脂飼料較油膩，小鼠采食量下降，所以體重下降。相比體重的變化，其肝指數(shù)的變化更有意義。試驗(yàn)中小鼠沒(méi)有表現(xiàn)肥胖癥狀，但有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，人類(lèi)體重正常時(shí)也存在發(fā)生NAFLD［6］。試驗(yàn)中病理組織檢驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)判定符合建模標(biāo)準(zhǔn)［2］。高脂組在4周時(shí)，已形成明顯的脂肪變性，在8周時(shí)有少量炎性細(xì)胞。由于四氯化碳的作用，復(fù)合組較高脂組有明顯的炎性浸潤(rùn)，且肝臟損傷明顯。并且兩組中膽囊出現(xiàn)不同程度變化，出現(xiàn)炎癥。膽囊炎和膽結(jié)石在非酒精性脂肪肝病也時(shí)常發(fā)生［7］。

高脂組與復(fù)合組TG含量不穩(wěn)定，總體呈升高趨勢(shì)。8周時(shí)，高脂組顯著高于復(fù)合組。高脂組與復(fù)合組T－CHO含量都明顯高于正常組，且在4～8周較穩(wěn)定。兩組造模結(jié)果符合NAFLD中的高脂血癥。試驗(yàn)中給予高脂飼料的小鼠TG與T－CHO呈上升趨勢(shì)，這與NAFLD患者中甘油三酯（TG）、總膽固醇（T－CHO）水平明顯高于對(duì)照組的文獻(xiàn)報(bào)道相符［8］。

試驗(yàn)4～8周高脂組和復(fù)合組GPT含量明顯高于正常組，符合建模標(biāo)準(zhǔn)［2］。血清GPT升高是反映肝臟損傷的標(biāo)志之一，在GPT、GOT及GGT等肝酶中，GPT與肝臟脂肪聚集關(guān)系最為密切，并且文獻(xiàn)報(bào)道GPT的升高可能會(huì)早于NAFLD［9］。復(fù)合組的GOT含量較高脂組要高，且在8周時(shí)，顯著高于高脂組。這與肝細(xì)胞損傷程度有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，血清GOT增高與NAFLD的進(jìn)展性肝纖維化相關(guān)［6］?？梢?jiàn)CCl4在誘導(dǎo)過(guò)程中，促進(jìn)了肝損傷和纖維化的進(jìn)程，也證實(shí)了外界的毒性物質(zhì)促進(jìn)非酒精性脂肪肝的發(fā)展。模型組中血清酶學(xué)指標(biāo)的升高與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，符合日常檢測(cè)的NAFLD患者血清酶學(xué)指標(biāo)［8、10］。

本試驗(yàn)在考慮高脂飼料與化學(xué)性物質(zhì)作用的因素下，結(jié)合以上各種分析，高脂組在高脂誘導(dǎo)4周后，得到的模型已符合人體NAFLD的主要特征。且得到的生化指標(biāo)可作為進(jìn)一步研究的參考。復(fù)合組中合用了化學(xué)性誘導(dǎo)物質(zhì)，主要考慮實(shí)際生活中，人們不可避免地會(huì)接觸到各種化學(xué)毒性物質(zhì)。四氯化碳可促使肝臟的炎癥和纖維化，與高脂合用對(duì)非酒精性脂肪肝疾病進(jìn)程有促進(jìn)作用。復(fù)合組8周可以考慮作為NAFLD的肝臟纖維化病變模型。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究發(fā)病機(jī)制及有效防止藥物奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Weston S R，Leyden W，Murphy，etal.Racial and ethnic distribution of nonalcoholic fatty liver in persons with newly diagnosed chronic liver disease［J］.Hepatology，2005，41：372－379.

［2］ 中華肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163－166.

［3］ 周光德，趙景民.非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）病理學(xué)評(píng)價(jià)、無(wú)創(chuàng)性診斷指標(biāo)篩選、發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)研究 ［D］.北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2007：5.

［4］ 劉俊平，范竹萍.從新視角評(píng)價(jià)非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型［J］.胃腸病學(xué)，2008，13（8）：502－504.

［5］ Eksted M，F(xiàn)ranzen L E，Mathiesen U L，etal.Statins in nonalcoholic fatty liver disease and chronically elevated liver enzymes：A histopathological follow－up study［J］.Journal of Hepatology，2007，47：135－141.

［6］ 荀運(yùn)浩，施軍平，胡晨波，等.血清AST水平與非酒精性脂肪性肝病的進(jìn)展性肝纖維化有關(guān)［J］.肝臟，2010，15（3）：160－163.

［7］ 盛黎，范竹萍，汪曉紅，等.非酒精性脂肪性肝病伴膽石癥的臨床與病理學(xué)研究 ［J］.肝臟，2009，14（5）：377－379.

［8］ Mofrad P，Contos M J，Haque M，etal.Clinical and Histologic Spectrum of Nonalcoholic Fatty Liver Disease Associated With Normal ALT Values［J］.Hepatology，2003，6（37）：1286－1292.

［9］ 張弛，劉瑛，李華珠，等.血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶在正常范圍內(nèi)對(duì)非酒精性脂肪性肝病的預(yù)測(cè)［J］.世界華人消化雜志，2011，19（8）：841－844.

［10］王蘭，厲有名.非酒精性脂肪性肝病機(jī)制及標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 ［D］.杭州：浙江大學(xué)，2009：5.