陳新華，康立超，黃 新，韓猛立，何延華

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團農(nóng)四師七十七團，新疆 伊犁835601；2.新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所 綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子832000）

新疆伊犁馬的主要繁育基地在昭蘇馬場，隨著自治區(qū)大畜牧業(yè)的發(fā)展，確定了“以馬產(chǎn)業(yè)為主導產(chǎn)業(yè)”的發(fā)展戰(zhàn)略，重點發(fā)展養(yǎng)馬業(yè)和馬產(chǎn)品的綜合產(chǎn)業(yè)。隨著馬產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，馬腺疫又重新抬頭，不僅阻礙了馬駒的生長發(fā)育，還影響著馬匹的美觀，甚至導致死亡。2011年在昭蘇馬場出現(xiàn)馬腺疫，發(fā)病率80%～100%，死亡率不高。病原分離鑒定及其16SrDNA序列分析報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源無菌采集6匹病馬的頜下淋巴結(jié)腫脹化膿液。

1.2 試劑 普通肉湯和瓊脂平板、5%綿羊鮮血平板、LB液體培養(yǎng)基、PBS水溶液，2xTaqPCR Master Mix、ddH20、DNA Marker DL－2 000，購自北京天根生化科技有限公司，鏈球菌生化鑒定試劑盒和鏈球菌生化編碼鑒定手冊，購自杭州天和微生物試劑有限公司；試驗用昆明系小鼠24只，購自石河子大學實驗動物中心。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化與染色鏡檢 將無菌采集的膿液劃線接種于普通瓊脂平板和綿羊鮮血平板，37℃培養(yǎng)48h后，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，直到菌落形態(tài)穩(wěn)定一致，保存菌種。

將膿液抹片，瑞氏染色和革蘭染色，挑取單菌落和肉湯培養(yǎng)物進行革蘭染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)特征。

1.3.2 生化鑒定 將分離菌分別接種于鏈球菌生化鑒定試劑盒，37℃培養(yǎng)24h，加入指示劑，觀察結(jié)果，根據(jù)鏈球菌生化編碼鑒定手冊（GYZ－12St）鑒別分析，認定指數(shù)接近100為可靠結(jié)果。

1.3.3 動物致病性試驗 挑取純化單菌落接種含5%新生犢牛血清的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)48h，采用涂布法進行活菌計數(shù)，并用無菌肉湯稀釋到5×108CFU/mL，試驗組每種菌腹腔注射3只小鼠（0.2 mL/只），對照組3只小鼠腹腔注射無菌肉湯。隔離飼養(yǎng)，定時觀察小鼠發(fā)病情況，死亡小鼠立即剖檢，觀察病變并采集小鼠心血和肝臟進行培養(yǎng)和鏡檢。

1.3.4 分離菌16SrDNA的PCR測序 （1）PCR模板的制備挑取該分離株致病菌純培養(yǎng)單菌落，用50μL ddH2O渦漩震蕩重懸，煮沸變性10min，12 000r/min離心2min，取上清液保存?zhèn)溆?。?）16SrDNA的PCR擴增細菌16SrDNA通用引物序列為 F27：5′－AGAGTTGATCCTGGCTCAG－3′，R1492：5′－AAGGAGGTGATCCAACCGCA－3′，欲擴增片段大小為1 500bp左右，上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；反應體系（20 μL）：2×TaqPCR Master Mix10μL、ddH2O 8μL、上下游引物各（10mmol/L）0.5μL、模板1μL；反應程序為95℃5min，95℃變性40s、56℃退火40s、72℃延伸1min 30s、30個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。（3）測序比對分析 單一條目的條帶PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序結(jié)果通過Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在 Gen－Bank中進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng) 從6匹病馬分別分離到7株菌，分別命名為XJYL－M1、XJYL－M2XJYL－M3、XJYL－M4、XJYL－M5、XJYL－M6－1和 XJYL－M6－2。

膿液抹片瑞氏染色見有大量球菌，革蘭染色呈陽性，彎曲的長鏈條。固體培養(yǎng)基上的分離菌形態(tài)多樣，單在或成叢排列。

XJYL－M1、XJYL－M2、XJYL－M3、XJYL－M4、XJYL－M5和XJYL－M6－2在普通肉湯和平板生長不良；5%綿羊鮮血平板上發(fā)生β型溶血，露珠狀小菌落周圍形成完全透明的溶血帶，寬度可達3mm；LB肉湯培養(yǎng)16h，上清液雖清亮，但搖動試管能看到管底有少量鏈狀的菌體纏繞一起，劇烈搖動才能使肉湯混濁，繼續(xù)培養(yǎng)后又沉到管底。

XJYL－M6－1在普通瓊脂平板生長良好，5%綿羊鮮血平板上發(fā)生β型溶血，LB肉湯培養(yǎng)可見混濁。

2.2 生化鑒定 生化鑒定結(jié)果見表1。

判定結(jié)果：XJYL－M1、XJYL－M2、XJYL－M3、XJYL－M4和XJYL－M5鑒定結(jié)果為馬鏈球菌（認定指數(shù)0.98，尚需鑒別）；XJYL－M6－1毗鄰乏養(yǎng)球菌（認定指數(shù)0.98，尚需鑒別），煙草法克拉姆氏菌（認定指數(shù)0.97，尚需鑒別），溶血孿生球菌（認定指數(shù)0.90，尚需鑒別）；XJYL－M6－2為苛求顆粒鏈球菌（0.98，尚需鑒別），動物獸疫鏈球菌（認定指數(shù)0.97，尚需鑒別）。

表1 分離菌的生化鑒定

2.3 動物致病性試驗 將分離菌的菌液接種小鼠后，試驗組小鼠在24～48h內(nèi)陸續(xù)全部死亡，取死亡小鼠肝臟和心血接種于血平板上，發(fā)生β溶血，取典型菌落涂片，革蘭染色鏡檢，證實分離到接種菌，對照組試驗鼠健活。

2.4 分離菌16SrDNA的PCR擴增分析 分離菌16srDNA PCR擴增產(chǎn)物，在預計大小處出現(xiàn)明顯的目的條帶（圖1）。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

對該株分離菌進行16SrDNA PCR測序，序列經(jīng)Blast比對，結(jié)果顯示，XJYL－M1、XJYL－M2、XJYL－M3、XJYL－M4和 XJYL－M5分離菌的 16S rDNA序列與馬鏈球菌馬亞種（Streptococcusequisubsp.equistrain）的同源性達100%，XJYL－M6－2的16SrDNA序列與馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcusequisubsp.zooepidemicusstrain）的同源性達100%，XJYL－M6－1的16SrDNA序列與金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureussubsp.aureus strain）的同源性達100%。

3 討論

本試驗從新疆伊犁某馬場暴發(fā)的馬腺疫膿液中分離篩選出7株革蘭陽性球菌，將分離菌株純化培養(yǎng)后，經(jīng)形態(tài)學鑒定、16SrDNA的克隆和序列分析，判定分離菌5株為馬鏈球菌馬亞種（Streptococcusequisubsp.equistrain）、1株為馬鏈球菌獸疫亞種 （Streptococcusequisubsp.zooepidemicus strain）和1株金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureussubsp.aureusstrain）。經(jīng)人工感染小鼠試驗證明分離菌具有一定的致病性。

馬腺疫是由馬鏈球菌馬亞種引起馬屬動物的一種急性接觸性傳染病。以發(fā)熱、上呼吸道黏膜發(fā)炎、頜下淋巴結(jié)腫脹化膿為特征。本試驗從1匹發(fā)病馬上分離到馬鏈球菌獸疫亞種和金黃色葡萄球菌。因此，馬腺疫的預防和治療不能再只針對馬鏈球菌馬亞種。

本試驗細菌生化鑒定結(jié)果為馬鏈球菌和動物獸疫鏈球菌等，有一定參考價值，但不能準確的鑒定此次分離菌，應該增加生化鑒定試驗的種類。本試驗利用PCR方法擴增16SrDNA序列，測定后，序列遞交NCBI進行B1ast比對，均可獲得與庫中細菌序列同源性很高的菌種名稱，結(jié)合生化鑒定從而可準確獲得待測細菌的種屬定位。

目前已得到超過2 500種的細菌16SrDNA基因序列，這使檢測工作更加容易，并且還可與其他分子生物學方法相結(jié)合以提高檢測效果。