陶弼菲，高其雙，陳志華，向 敏，占才耀，錢運國，夏 瑜，華 娟，王蓮芳，任 遠(yuǎn)，黃海軍

（武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢430208）

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte－macrophage colony stimulating factor，GM－CSF）為糖基化蛋白，分子量為18～23kD，由活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生。GM－CSF是一種具有多項潛能的造血生長因子，可以刺激和活化巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和各種APCs的增殖、分化，常用作DNA疫苗的免疫佐劑，以克服DNA疫苗免疫原性差的缺陷［1］。目前，GM－CSF已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)疫苗佐劑的研究，在細(xì)菌性和病毒性疾病、真菌及寄生蟲感染和惡性腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［2－4］。

但是，將pGM－CSF作為高效疫苗佐劑廣泛應(yīng)用，需要尋找一種經(jīng)濟簡捷、便于大量表達(dá)的系統(tǒng)。目前國內(nèi)外關(guān)于pGM－CSF的表達(dá)研究相對較少，且尚未建立穩(wěn)定表達(dá)pGM－CSF的哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本試驗建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且高效表達(dá)pGMCSF的BHK－21轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，為下一步從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取目的蛋白并最終開發(fā)出一種用于提高動物疫苗免疫效力的新型生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000和篩選試劑G418，均由Invitrogen公司生產(chǎn)；DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、胰蛋白酶、PBS，由Gibco公司生產(chǎn)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker、DNA Gel Extraction Kit，由華美生物工程公司生產(chǎn)；RNeasy Mini RNA提取試劑盒，由Qiagen（德國）公司生產(chǎn)；蛋白胨和酵母浸提液，由Oxoid公司生產(chǎn)；豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（pGM－CSF）ELISA檢測試劑盒，由US Biological公司生產(chǎn)；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞 大腸桿菌DH5α為本室保存；質(zhì)粒pMD18－T，由TaKaRa公司提供。質(zhì)粒載體pIRES2－EGFP－ pGM－CSF，由本實驗室構(gòu)建［5］。BHK－21細(xì)胞，購自武漢中博生物股份有限公司，在本實驗室傳代保存。

1.3 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬PGM－CSF的BHK－21細(xì)胞系 將復(fù)蘇后傳代3次的BHK－21細(xì)胞消化，用含10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)成1×105個/mL的密度，接種于若干個直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每種類型細(xì)胞挑選細(xì)胞融合至70%～80%、生長狀態(tài)較好的組，按照Lipofeetamine 2 000操作說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，脂質(zhì)體、質(zhì)粒每孔添加量均為6 μL，對照組不加脂質(zhì)體。6h后更換有血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，開始用G418篩選，前5天200μg/mL，接著用1 000μg/mL的濃度繼續(xù)篩選，直至絕大部分細(xì)胞死亡，并且長出新的細(xì)胞集落。將G418濃度改為2 000μg/mL維持篩選4周。

1.4 單個細(xì)胞篩選法建立高效轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株 將獲得的轉(zhuǎn)pGM－CSF的BHK－21細(xì)胞采用極限稀釋法傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔大約1個細(xì)胞，使用G418（1 000μg/mL）培養(yǎng)基至其長出單個克隆集落，在熒光顯微鏡下挑選出最優(yōu)的細(xì)胞克隆集落繼續(xù)擴繁培養(yǎng)。

1.5 PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中目的基因的表達(dá)應(yīng)用TRIZOL Reagent試劑盒并按其說明書分別提取轉(zhuǎn)pGM－CSF的BHK－21細(xì)胞和正常未轉(zhuǎn)染的BHK－21細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物用DNaseⅠ37℃處理20min以去除基因組DNA污染。所用引物：P1：5′－CTCAGAAGGATGTGGC－3′，P2：5′－TTACTTTTTGACTGGC－3′。PCR 反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，59℃退火40s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)。最后一輪72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取3μL產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.6 ELISA方法測定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白表達(dá)水平 按照豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（pGM－CSF）ELISA檢測試劑盒的說明書檢測上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株培養(yǎng)上清中pGM－CSF蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 單個細(xì)胞篩選法建立高效轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株 通過單個細(xì)胞篩選法建立了高效轉(zhuǎn)pGM－CSF基因的BHK－21細(xì)胞株9個。其建立過程見圖1。

2.2 PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中目的基因的轉(zhuǎn)錄情況 通過PCR方法，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中檢測到目的基因pGM－CSF基因的轉(zhuǎn)錄（圖2）。

2.3 Elisa方法測定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白表達(dá)水平 用“Curve Exert 1.3”軟件繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。結(jié)果為 Y＝1.4177889＋371.67168X＋69.318336X2（其中X為OD值，Y為對應(yīng)的樣品濃度），將該結(jié)果Y乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為細(xì)胞培養(yǎng)上清中外源蛋白pGM－CSF的真實濃度。ELISA檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)上清中pGM－CSF表達(dá)水平達(dá)到329.37±13.76ng/mL（表1）。

3 討論

醫(yī)學(xué)研究表明，GM－CSF基因是目前激活免疫系統(tǒng)的最有效基因［6］。在生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，重組人GM－CSF已在大腸桿菌、植物細(xì)胞如煙草、昆蟲細(xì)胞、家蠶細(xì)胞等以及小鼠和大鼠體內(nèi)獲得表達(dá)，各種體系所表達(dá)的重組GM－CSF與天然GM－CSF多少有些差異，或者活性較低，或者存在完全性隱患。據(jù)報道，哺乳動物體系如COS細(xì)胞表達(dá)的人GMCSF與天然的人GM－CSF有相同的生物學(xué)活性，但表達(dá)水平較低，在0.05μg/mL～0.07μg/mL［7］。如何建立完善的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系，仍然有許多環(huán)節(jié)需要系統(tǒng)深入的研究。

在生物制藥中廣泛使用的哺乳動物細(xì)胞，主要有中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（Chinese hamster ovary cell line，CHO）和倉鼠幼腎細(xì)胞系（Baby hamster kidney，BHK）等細(xì)胞。由BHK－21細(xì)胞構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或稱工程細(xì)胞，已廣泛用于預(yù)防和治療性生物技術(shù)藥物的生產(chǎn)，如基因工程乙型肝炎（乙肝）疫苗、促紅細(xì)胞生成素、纖溶蛋白激活劑等，并取得了巨大社會效益和經(jīng)濟效益。

圖1 轉(zhuǎn)pGM－CSF基因的BHK－21細(xì)胞株建立過程

圖2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中目的基因pGM－CSF的轉(zhuǎn)錄

圖3 pGM－CSF標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表1 細(xì)胞培養(yǎng)上清中外源蛋白pGM－CSF的含量

豬GM－CSF的表達(dá)研究在國內(nèi)還處于起步階段，在國外也并不完善，尚無建立穩(wěn)定表達(dá)豬GMCSF的哺乳動物細(xì)胞系的報道［8－10］。本試驗采用單個細(xì)胞克隆篩選法建立了高效轉(zhuǎn)pGM－CSF基因的BHK－21細(xì)胞株9個，一方面證實該技術(shù)具有較好的普遍實用性且成本低廉，對細(xì)胞損傷影響也不大。另一方面為下一步研究pGM－CSF蛋白的表達(dá)、純化及作為高效疫苗佐劑的制備奠定了基礎(chǔ)。

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