斯日古楞，么宏強(qiáng)，馬學(xué)恩，周建華

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱150030）

綿羊肺腺瘤病毒（JSRV）gag基因所編碼的衣殼蛋白（CA）是JSRV的主要核心蛋白，構(gòu)成病毒粒子雙層殼的內(nèi)殼－即衣殼，具有疏水性，其氨基酸序列比較保守，在感染晚期對(duì)病毒的裝配和出芽發(fā)揮重要功能［1］。CA抗原不僅在不同毒株中高度保守，而且在病毒粒子中含量高且容易制備，因此CA蛋白一直被選作為商品化診斷抗原。

使克隆的基因在細(xì)胞中表達(dá)在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中都具有十分重要的意義?？寺〉幕蛑挥型ㄟ^表達(dá)才能探索和研究基因的功能以及其表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。為了進(jìn)一步研究CA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能等奠定基礎(chǔ)，本試驗(yàn)中構(gòu)建其真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在真核細(xì)胞中的高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了有效鑒定。報(bào)告如下。

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pcD－NA3.1（＋）真核表達(dá)載體等，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。重組原核表達(dá)質(zhì)粒，本課題組保存。

1.2 細(xì)胞 293細(xì)胞和Hela細(xì)胞，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3 抗體 抗HA小鼠單抗（TIANGEN）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（Sigma公司）。

1.4 培養(yǎng)基 DMEM培養(yǎng)基（Sigma公司）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司）；0.25%胰酶、2mmol/L L－谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.5 主要試劑 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）；質(zhì)粒提取試劑盒 （Promega公司）；PrimerSTARTMHS DNA聚合酶、5×PrimerST ARTM Buffer、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase（寶生物工程（大連）有限公司）；Western Blotting ECL超敏發(fā)光液（普利萊基因技術(shù)有限公司）；LB培養(yǎng)基及其余生化試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 重組原核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR法及EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，并以其為模板，采用含HA標(biāo)記序列的引物及PrimerSTARTMHS DNA高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

膠回收純化的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3.1（＋），雙酶切純化后，連接轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定。陽性克隆進(jìn)行核苷酸序列的測定。

2.2 pcDNA3.1（＋）－CA－HA 在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

2.2.1 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞 將293細(xì)胞和Hela細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的條件下，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)2～3d后，再消化傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前在6孔板每孔鋪5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。第2天，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2.2 檢測pcDNA3.1（＋）－CA－HA 在真核細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.2.1 間接免疫熒光法檢測 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)至35h時(shí)，用PBS洗滌，并用預(yù)冷的無水乙醇在室溫固定20min；PBS洗滌，將一抗（HA單抗）滴加于固定細(xì)胞上，室溫孵育2h；PBS洗滌3遍，每次5min；加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育1h，PBS洗滌3遍，每次5min?？蛰d體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對(duì)照；未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（＋）－CAHA質(zhì)粒的293細(xì)胞和Hela細(xì)胞為空白對(duì)照。倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光強(qiáng)度。

2.2.2.2 Western Blotting法檢測 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)至18h、24h、36h和48h時(shí)，用PBS洗滌，應(yīng)用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE電泳；應(yīng)用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；廢棄封閉液，加入一抗，室溫孵育2h；用TBST洗膜3次，每次5min；再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h；用TBST洗膜3次，每次5min；加入Western Blotting超敏發(fā)光液，用化學(xué)發(fā)光法在成像儀下曝光檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

3 結(jié)果

重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

3.1.1 CA－HA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果采用PCR法以原核表達(dá)質(zhì)粒（經(jīng)PCR及雙酶切法鑒定）作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，符合預(yù)期片段大小585bp，見圖1。

圖1 CA－HA基因的PCR擴(kuò)增

3.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定 采用PCR、酶切法鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）－CA－HA，之后對(duì)陽性的重組子進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示，目的基因序列與原序列完全一致，未發(fā)生突變，讀碼框架和插入方向完全正確。

檢測pcDNA3.1（＋）－CA－HA在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

3.2.1 間接免疫熒光檢測結(jié)果 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和Hela細(xì)胞35h后，用倒置熒光顯微鏡檢測，可以看到綠色熒光細(xì)胞，且熒光都位于細(xì)胞膜，對(duì)照無熒光出現(xiàn)，見圖2。此結(jié)果證實(shí)所克隆的CA基因，在異源啟動(dòng)子CMV的作用下，在真核細(xì)胞中可以表達(dá)，而且表達(dá)在細(xì)胞膜上。

3.2.2 Western blotting檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染后，分別在18、24、36、48h時(shí)裂解細(xì)胞，裂解產(chǎn)物經(jīng) Westhern blotting檢測，結(jié)果顯示，在25kDa處可見特異條帶，而對(duì)照未檢測到此條帶，見圖3，說明真核表達(dá)載體pcDNA3.1（＋）－CA－HA可在真核細(xì)胞中已成功表達(dá)了CA蛋白。

圖2 間接免疫熒光方法檢測CA－HA基因在293細(xì)胞和Hela細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 Western blotting方法檢測在293細(xì)胞和Hela細(xì)胞中的表達(dá)

4 討論

JSRV的衣殼蛋白（CA）是JSRV的主要核心蛋白，構(gòu)成病毒粒子雙層殼的內(nèi)殼，它在病毒早期感染與脫衣殼過程中可以穩(wěn)定未整合的前病毒DNA［2－3］，CA攜帶群特異抗原決定簇，其抗原性十分保守。反轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后，大多數(shù)情況下不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞造成損害，成為隱性感染，目前該病可能發(fā)生機(jī)制是由于病毒的LTR中所含病毒轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子影響前病毒DNA插入宿主細(xì)胞，激活了宿主細(xì)胞的原癌基因，或造成抑癌基因的失活［4－5］。

本試驗(yàn)中，為了除去原核融合表達(dá)蛋白的GST標(biāo)簽并獲得體外表達(dá)的具有類似天然病毒蛋白生物學(xué)活性的CA蛋白，構(gòu)建了CA基因的真核表達(dá)載體并進(jìn)行真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。因無相應(yīng)的抗體及陽性血清可檢測JSRVCA蛋白的表達(dá)，故在設(shè)計(jì)本試驗(yàn)時(shí)CA基因中融入HA序列，以便于檢測目的基因的表達(dá)。經(jīng)酶切鑒定及測序與預(yù)期一致基因序列比較分析結(jié)果顯示，沒有發(fā)生無義突變，已成功構(gòu)建了含有CA基因的真核表達(dá)載體，并用該載體經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和Hela細(xì)胞后，通過間接免疫熒光方法及 Western blotting方法檢測證實(shí)，該載體可在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)外源性目的基因CA，在熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞內(nèi)外源蛋白CA廣泛分布于細(xì)胞膜上，并且 Western blotting檢測結(jié)果表明，有特異的蛋白表達(dá)。因此，可以認(rèn)為本試驗(yàn)所構(gòu)建的真核表達(dá)載體是成功的。本試驗(yàn)對(duì)CA蛋白單克隆抗體進(jìn)行初步鑒定、篩選，為建立特異性的診斷試劑盒奠定良好的基礎(chǔ)。本結(jié)果為進(jìn)一步研究CA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，以及從分子水平探討CA基因免疫等奠定了理論基礎(chǔ)。

［1］ Tustin R C，Williamson A－L，York D F.Experimental transmission of Jaagsiekte（ovine pulmonary adenomatosis）to goats［J］.Onderstepoort J Vet Res，1988，50：309－316.

［2］ Brown P O.Integration of retroviral DNA［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1990，157：19－48.

［3］ Brown P O.Integration［M］.In：Retroviruses（J M Coffin，S H Hughes and H E Varmus，Eds.），New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1997：161－203.

［4］ Deluca C，Kwon H，Pelletier N，etal.NF－K B protects HIV－1infected myeloid cells from apoptosis［J］.Virology，1998，244：27－38.

［5］ Carlson J，Bishop J，Lyon M，etal.Chromosomal distribution of endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus proviral sequences in the sheep genome［J］.Journal of Virology，2002，75：4239－4246.