周涌濤 劉佳 張燕莉 張新卿 郭秀海 陳彪 賈建平

帕金森?。≒D）是老年人群中常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，盡管其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明遺傳因素和免疫機(jī)制參與了疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)PD患者腦組織中存在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，并廣泛表達(dá)細(xì)胞因子等炎性物質(zhì)，且患者腦脊液中腫瘤壞死因子α（TNFα）等細(xì)胞因子水平升高，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期應(yīng)用非甾體藥物可減少 PD 的 發(fā) 生［1－3］。TNFα 與 TNF 受 體 1（TNFR1）相互作用可產(chǎn)生興奮性毒性物質(zhì)，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常，黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡［4－7］。目前有關(guān)其受體多態(tài)性與PD之間關(guān)系的研究較少。一項(xiàng)來自德國(guó)人群的研究發(fā)現(xiàn)TNFRSF－609和＋36位點(diǎn)可能為PD的保護(hù)性因素［8－11］，近來研究發(fā)現(xiàn)TNFα的水平與PD患者非運(yùn)動(dòng)癥狀相關(guān)，如可影響患者的認(rèn)知功能、睡眠及情緒等［12］。本研究采用病例對(duì)照的研究方法，探討了TNFR1－383A／C基因多態(tài)性與PD之間的關(guān)聯(lián)性，并探討該基因多態(tài)性對(duì)PD發(fā)病年齡及運(yùn)動(dòng)癥狀的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 PD組:共518例，來自宣武醫(yī)院帕金森病專科門診以及全國(guó)多中心的藥物實(shí)驗(yàn)（北京、成都、上海、天津、長(zhǎng)沙、武漢、青島及哈爾濱）。入組標(biāo)準(zhǔn):（1）符合 PD 診斷［13］；（2）年齡≥50歲；（3）無PD家族史；（4）經(jīng)過1年以上隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):（1）具有其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾??；（2）患有腦血管?。唬?）有精神系統(tǒng)疾病。平均發(fā)病年齡（61.35±8.34）歲，確診時(shí)平均年齡（65.03±7.92）歲，其中男317例、女201例。所有患者均無遺傳關(guān)聯(lián)性，獲得患者本人知情同意并簽訂知情同意書。

1.1.2 對(duì)照組:共521名，從北京老年化縱向研究的數(shù)據(jù)庫(kù)（數(shù)據(jù)庫(kù)共2200名北京社區(qū)人群，收集日期為2005－04－2009－06）中隨機(jī)抽取，入組者第1次隨訪年齡在50歲以上且病史中無神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，共隨訪4年。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量熒光 PCR（real time PCR，RTPCR）［9］:（1）應(yīng)用氯仿抽提的方法提取外周血中的DNA；（2）引物和Taq酶由Roche公司提供，應(yīng)用RT－PCR［9］進(jìn)行檢測(cè)；兩對(duì)引物序列為:第1對(duì):上游 5′－TCCAGGACTGCATGGAC－3′和 下 游 5′－AAAAGTCCTTACCTCGGCAGT－3′，第2對(duì):上游5′－GTCCAGGACTGCATGGAT－3′，下 游 5′－AAAAGTCCTTACCTCGGCAGT－3′；（3）RTPCR擴(kuò)增的總體積為50μL，其中含有deltZ05、10×deltZ05緩沖液、10mmol／L dNTP、200μmol／L ROX、20×SYBR Green、80%（體積分?jǐn)?shù)）甘油、100%DMSO。PCR反應(yīng)條件:95℃初變性12 min，然后95℃20s，58℃退火20s，45個(gè)循環(huán)后，從60℃進(jìn)行解離20min。實(shí)驗(yàn)操作流程和數(shù)據(jù)分析通過羅氏公司抽查和重復(fù)測(cè)試，進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.2 TNFR1－383A／C 基因多態(tài)性與 PD 的相關(guān)性:分析TNFR1－383A／C基因型和等位基因頻率在不同性別、發(fā)病年齡以及有無震顫者等之間的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用Mantal－Haenszelχ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，應(yīng)用非條件Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，并計(jì)算OR 和95%CI。應(yīng)用 Kaplan－Meier、life table和 Cox－regression方法分析基因多態(tài)性對(duì)發(fā)病年齡的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNFR1－383A／C基因型和等位基因頻率TNFR基因型的分布符合Hardy－Weinberg平衡（P＜0.05）。病例組和對(duì)照組CC、CA和AA基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），C和A等位基因頻率在兩組間比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。PD患者發(fā)病年齡≥65歲亞組C等位基因頻率顯著低于對(duì)照組≥65歲亞組（6.74%vs.10.10%，P＜0.05），并可減少晚發(fā)型PD發(fā)病的危險(xiǎn)性（OR:0.64，95%CI:0.43～0.97，P＜0.05）。兩組同性別間未見C等位基因頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。具體結(jié)果見表1。

把病例和對(duì)照組進(jìn)行年齡匹配，利用非參數(shù)Logistic回歸模型對(duì)性別進(jìn)行調(diào)整，未發(fā)現(xiàn)C／C基因型可影響SPD發(fā)病的危險(xiǎn)性（OR:0.55，95%CI:0.13～2.33，P＝0.418），也未發(fā)現(xiàn) TNFR1－383A／C／C等位基因?qū)PD發(fā)病有顯著影響（OR:0.85，95%CI:0.61～1.19，P＝0.347）。

2.2 TNFR1－383A／C基因多態(tài)性對(duì)臨床特征的影響 震顫組和非震顫組CC、CA和AA基因型的頻率以及C和A等位基因的頻率與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 對(duì)照組和病例組TNFR1基因型和等位基因的分布 〔n（%）〕

2.3 利用生存分析確定基因多態(tài)性對(duì)發(fā)病年齡的影響 CC、CA和AA基因型患者的發(fā)病年齡的中位數(shù)分別為54歲（95%CI:46～62歲）、62歲（95%CI:58～66歲）和61歲（95%CI:60～62歲），各基因型患者間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.16），攜帶C／C等位基因的個(gè)體并未延遲SPD發(fā)病年齡。攜帶C和非C等位基因個(gè)體發(fā)病年齡的中位數(shù)分別為61歲（95%CI:58～64歲）與61歲（95%CI:60～62歲），兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利用生存分析進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)攜帶C等位基因的個(gè)體并不能延遲SPD的發(fā)病年齡（C allele vs.non－C allele log rankχ2＝0.22，P＝0.86）。

3 討論

TNFR1基因位于12p13.31，包含10個(gè)外顯子，編碼TNFR1蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為55000～60000。TNFR1屬于跨膜蛋白受體，膜外包括富含半胱氨酸的區(qū)域，有核細(xì)胞上均有低水平表達(dá)，包括大腦的各個(gè)區(qū)域，參與了TNF作用的調(diào)節(jié)，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、內(nèi)皮細(xì)胞激活或黏附、抗病毒、非淋巴細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞毒性作用和凋亡。在PD患者黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)發(fā)現(xiàn)TNFR1表達(dá)水平升高，但TNFR2的水平?jīng)]有改變，并在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)TNFR1對(duì)神經(jīng)元具有毒害作用，而TNFR2則具有保護(hù)作用［4－6，14］。對(duì)于 TNFR1基因位點(diǎn)－609和＋36位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)其可能為PD發(fā)病的保護(hù)性因素，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)TNFR1－383A／C多態(tài)性與SPD之間關(guān)系的研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，TNFR1－383A／C基因型和等位基因在病例組和對(duì)照組之間未存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，病例組CC基因型頻率低于對(duì)照組，并未發(fā)現(xiàn)CC基因型和C等位基因可影響SPD發(fā)病的危險(xiǎn)性，通過對(duì)性別和年齡調(diào)整之后仍未發(fā)現(xiàn)兩者間具有相關(guān)性。但按照性別和年齡分層分析后發(fā)現(xiàn)，高齡PD患者（發(fā)病年齡≥65歲）C等位基因頻率顯著低于對(duì)照組，并可減少晚發(fā)型PD發(fā)病的危險(xiǎn)性，表明在發(fā)病年齡≥65歲人群中C等位基因仍是SPD的保護(hù)性因素，提示TNFR1－383A／C基因多態(tài)性與SPD的保護(hù)性作用有關(guān)。進(jìn)一步分析TNFR1－383A／C對(duì)發(fā)病年齡的影響發(fā)現(xiàn)，具有C和A等位基因者的發(fā)病年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明C等位基因并不能影響SPD的發(fā)病年齡。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)PD患者的起病形式有的以震顫為主，而許多患者并無震顫，而以運(yùn)動(dòng)遲緩和肌強(qiáng)直為主。本研究并未發(fā)現(xiàn)TNFR1－383A／C基因型和等位基因與SPD的臨床表現(xiàn)存在相關(guān)性，表明該位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)SPD的運(yùn)動(dòng)癥狀并未產(chǎn)生影響。本研究與德國(guó)研究均發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可能對(duì)SPD的發(fā)病具有保護(hù)性作用［8－11］。其機(jī)制可能為該突變位點(diǎn)可能通過影響TNF－αmRNA水平和表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)節(jié)TNF－α體內(nèi)的水平，從而影響SPD的病理過程［14］。本研究在基因型和等位基因頻率與其他研究結(jié)果之間存在差異［15－16］，其原因主要考慮與種族差異、地理區(qū)域以及飲食習(xí)慣不同等因素有關(guān)，也不能完全排除本研究中的病例對(duì)照區(qū)域不匹配導(dǎo)致。

綜上所述，TNFR1－383A／C可能與SPD高齡人群的發(fā)病存在相關(guān)性，這與既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、流行病學(xué)研究以及腦脊液生化研究的結(jié)果存在不同，因而需要通過對(duì)其他易感位點(diǎn)進(jìn)行深入研究以確定其與SPD的關(guān)系。

［1］Arai H，F(xiàn)uruya T，Mizuno Y，et al.Inflammation and infection in Parkinson’s Disease［J］.Histol Histopathol，2006，21:673－678.

［2］Lucas SM，Rothwell NJ，Gibson RM.The role of inflammation in CNS injury and disease［J］.Brit J Pharmacol，2006，147:S232－S240.

［3］Chen H，Jacobs E，Schwarzschild MA，et al.Nonsteroidal antiinflammatory drug use and the risk of Parkinson’s disease［J］.Ann Neurol，2005，59:988－989.

［4］Hirsch EC，Breidert T，Rousselet E，et al.The role of glial reaction and inflammation in Parkinson’s disease［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，991:214－228.

［5］Nagatsu T，Sawada M.Inflammatory process in Parkinson’s disease:role for cytokines［J］.Curr Pharm Des，2005，11:999－1016.

［6］Nagatsu T，Sawada M.Cellular and molecular mechanisms of Parkinson’s disease:neurotoxins，causative genes，and inflammatory cytokines［J］.Cell Mol Neurobiol，2006，26:781－802.

［7］Whitton PS.Inflammation as a causative factor in the aetiology of Parkinson’s disease［J］.Br J Pharmacol，2007，150:963－976.

［8］Tansey MG，F(xiàn)rank－Cannon TC，McCoy MK，et al.Neuroin－flammation in Parkinson’s disease:is there sufficient evidence for mechanism－based interventional therapy？［J］.Front Biosci，2008，13:709－717.

［9］Nishimura M，Mizuta I，Mizuta E，et al.Tumor necrosis factor gene polymorphisms in patients with sporadic Parkinson’s disease［J］.Neurosci Lett，2001，311:14.

［10］Wu YR，F(xiàn)eng IH，Lyu RK，et al.Tumor necrosis factor－alpha promoter polymorphism is associated with the risk of Parkinson’s disease［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2007，144B:300－304.

［11］Krüger R，Hardt C，Tschentscher F，et al.Genetic analysis of immunomodulating factors in sporadic Parkinson’s disease［J］.J Neural Transm，2000，107:553－562.

［12］Menza M，Dobkin RD，Marin H，et al.The role of inflammatory cytokines in cognition and other non－motor symptoms of Parkinson’s disease［J］.Psychosomatics，2010，51:474－479.

［13］Gelb DJ，Oliver E，Gilman S.Diagnostic criteria for Parkinson disease［J］.Arch Neurol，1999，56:33－39.

［14］Nagatsu T，Sawada M.Cellular and molecular mechanisms of Parkinson’s disease:neurotoxins，causative genes，and inflammatory cytokines［J］.Cell Mol Neurobiol，2006，26:781－802.

［15］Nishimura M，Obayashi H，Mizuta I，et al.TNF，TNF receptor type 1，and allograft inflammatory factor－1gene polymorphisms in Japanese patients with type 1diabetes［J］.Hum Immunol，2003，64:302－309.

［16］Bridges SL Jr，Jenq G，Moran M，et al.Single－nucleotide polymorphisms in tumor necrosis factor receptor genes:definition of novel haplotypes and racial／ethnic differences［J］.Arthritis Rheum，2002，46:2045－2050.