謝甬淋 戚飛騰 童洋萍 畢涌 張旭

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose－derived stem cells，hADSCs）最初是由Zuk等［1］從人脂肪組織中分離得到的一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞［2］。hADSCs在一定條件下可以分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，并且具有特殊的免疫調(diào)節(jié)作用［3］，常用于自身免疫性疾病的研究。hADSCs自抽脂手術(shù)廢棄的脂肪中分離［1］，取材豐富，無(wú)痛苦，不受倫理學(xué)限制，是具有巨大開(kāi)發(fā)潛能的組織基因工程種子細(xì)胞。hADSCs體外培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)量需要3～4周，要實(shí)現(xiàn)隨時(shí)為臨床和基礎(chǔ)研究提供足量的hADSCs，建立行之有效的凍存方法非常必要。確保凍存后細(xì)胞的存活率、增殖能力及細(xì)胞表面分子不受影響，是相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究順利進(jìn)行的保障。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種高效地分離及凍存hADSCs的方法，分析凍存前后hADSCs的生物學(xué)特征，為進(jìn)一步探究其生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 脂肪組織來(lái)自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院整形科，捐贈(zèng)者無(wú)重大疾病史，經(jīng)捐贈(zèng)者同意。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。Ⅰ型膠原酶購(gòu)自Worthington公司，胎牛血清、低糖DMEM購(gòu)自Gibico公司，hADSCs完全培養(yǎng)基購(gòu)自廣州賽業(yè)公司，細(xì)胞表面分子抗體購(gòu)自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分離培養(yǎng):無(wú)菌條件下收集塊狀脂肪組織5～10g，浸泡在含有抗生素的低糖DMEM中。清除肉眼可見(jiàn)的血管組織，用含有抗生素的低糖DMEM反復(fù)沖洗3次以去除血細(xì)胞及其他雜質(zhì)，無(wú)菌剪刀將組織塊盡量剪碎。將脂肪組織置于雙倍體積的0.1%（質(zhì)量濃度）Ⅰ型膠原酶中，37℃震蕩水浴鍋中消化60min，每10min取出用力震蕩以促使組織充分消化。消化后加入等體積含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的低糖DMEM，400 g離心10min。棄去上層油脂及未消化的脂肪組織，沉淀用紅細(xì)胞裂解液裂解10min后，400 g離心10min，低糖的DMEM清洗2次后，以100目篩網(wǎng)過(guò)濾、400 g離心10min。用hADSCs完全培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞后接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，此后每隔2d換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，以0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 hADSCs凍存和復(fù)蘇:取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的第3代細(xì)胞，以0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化、以300 g離心5min，加入預(yù)冷的凍存液〔70%（體積分?jǐn)?shù)）DMEM、20%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清、10%（體積分?jǐn)?shù)）DMSO；均為終濃度〕重懸，調(diào)整細(xì)胞密度1×106／mL。置于程序降溫凍存盒中，－80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至液氮冰箱貯存。6個(gè)月后從液氮中取出細(xì)胞，立即置于38℃～40℃水浴鍋中迅速融化后轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有培養(yǎng)液的離心管中，以300 g離心5 min，hADSCs完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 復(fù)蘇后細(xì)胞存活率檢測(cè):復(fù)蘇后，取適量細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液與0.4%（質(zhì)量濃度）臺(tái)盼藍(lán)溶液按9∶1比例混勻，3min內(nèi)光鏡下觀察，計(jì)數(shù)被染成藍(lán)色的死細(xì)胞數(shù)和拒染的活細(xì)胞數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算復(fù)蘇后細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝活細(xì)胞數(shù)／（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.4 MTT法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:以0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104／mL，接種至96孔板，每孔200μL，置37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于第2天開(kāi)始，每天于同一時(shí)間隨機(jī)取1塊96孔板，每孔加入5mg／mL的MTT液20μL，37℃孵育4h，吸去上清，每孔加入150μL DMSO，震蕩混勻10 min。酶標(biāo)儀上檢測(cè)450nm處吸光度值。連測(cè)8 d，以吸光度值為縱軸，時(shí)間（d）為橫軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。吸光度值與細(xì)胞數(shù)量成正比。

1.2.5 hADSCs細(xì)胞表面分子檢測(cè):0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化細(xì)胞，300 g離心5min，PBS清洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106／mL。分別加入抗人CD44－FITC、CD105－APC、CD29－FITC、CD73－PE、CD31－PE、HLA－DR－APC，以 FITC－IgG1、APCIgG1、PE－IgG1為同型對(duì)照。于4℃、避光孵育30 min，PBS清洗2次，最后加入200μL PBS重懸上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)初期見(jiàn)大量懸浮細(xì)胞和脂肪滴，24h后細(xì)胞基本貼壁，呈圓形；3d后首次換液，可見(jiàn)少量長(zhǎng)梭形細(xì)胞；6d后細(xì)胞融合基本達(dá)80%，細(xì)胞大小均等，成漩渦狀、編織狀生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)后，4d后可達(dá)80%融合，細(xì)胞形態(tài)較均一，呈纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)（圖1A）。復(fù)蘇后，hADSCs仍保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，第二天觀察貼壁良好，呈梭形（圖1B）。

圖1 第3代hADSCs凍存前（A）后（B）的形態(tài)（×100）

2.2 復(fù)蘇細(xì)胞存活率 復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為（91.25±3.02）%。

2.3 凍存前后hADSCs生長(zhǎng)曲線 凍存前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本無(wú)差別，均呈“S”形。細(xì)胞經(jīng)過(guò)2～3d潛伏期后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，7d后進(jìn)入平臺(tái)期，8d后細(xì)胞數(shù)稍有下降（圖2）。

圖2 凍存前后hADSCs生長(zhǎng)曲線

2.4 凍存前后hADSCs細(xì)胞表面分子檢測(cè) 凍存前，CD44、CD105 雙陽(yáng)性細(xì)胞占（99.850±0.001）%，CD29、CD73雙陽(yáng)性細(xì)胞占（92.600±0.028）%，CD31陽(yáng)性細(xì)胞占（4.186±0.010）%、HLA－DR陽(yáng)性細(xì)胞占（1.02±0.007）%。凍存后，CD44、CD105雙陽(yáng)性細(xì)胞占（98.060±0.028）%；CD29、CD73雙陽(yáng)性細(xì)胞占（91.224±0.041）%；CD31陽(yáng)性細(xì)胞占（3.832±0.009）%、HLA－DR陽(yáng)性細(xì)胞占（1.514±0.006）%。各指標(biāo)凍存前后比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明凍存前后hADSC均高度表達(dá)CD44、CD105、CD29、CD73，CD31、HLA－DR幾乎不表達(dá)。

3 討論

干細(xì)胞研究為實(shí)現(xiàn)組織和器官的修復(fù)帶來(lái)了新的技術(shù)革新。即使胚胎干細(xì)胞具有分化成為所有細(xì)胞類型的潛能，但由于其來(lái)源于胚胎組織，臨床應(yīng)用受到倫理限制，因此成體干細(xì)胞的研究將具有更加深遠(yuǎn)的意義。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）最初從骨髓中提取，隨后研究證明在中胚層的其他組織如脂肪、胎盤、臍帶、滑膜等都能提取，來(lái)源豐富［4］。相對(duì)于骨髓 MSCs，脂肪來(lái)源的 MSCs，即hADSCs，取材于抽脂術(shù)或外科手術(shù)中棄去的皮下脂肪，可使患者免受抽骨髓取材的痛苦［5］。近年來(lái)研究顯示，MSCs具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力，可在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中抑制T細(xì)胞功能，改變輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）的平衡，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）產(chǎn)生［6］。Najar等研究指出hADSCs相比骨髓MSCs具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用［7］，被視為治療自身免疫疾病如多發(fā)性硬化、移植物抗宿主病等比較理想的種子細(xì)胞［8］。因此，成功分離出hADSCs，實(shí)現(xiàn)其在體外擴(kuò)增，是進(jìn)一步探究其生物學(xué)作用和進(jìn)行移植研究的基礎(chǔ)；而實(shí)現(xiàn)體外長(zhǎng)期凍存hADSCs，隨時(shí)為臨床移植和科學(xué)研究提供充足干細(xì)胞，將是研究hADSCs的重要保障。

本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化與離心相結(jié)合的方法，從人腹部脂肪組織中高效分離出MSCs，其貼壁生長(zhǎng)、形態(tài)為長(zhǎng)梭形，具有良好的增殖能力，可在體外連續(xù)擴(kuò)增傳代。凍存細(xì)胞時(shí)采用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，利用程序降溫凍存盒實(shí)現(xiàn)“慢凍”，使細(xì)胞內(nèi)水分充分滲出，然后在液氮冰箱中長(zhǎng)期保存細(xì)胞。與“4℃30min→－20℃2h→－0℃ 過(guò)夜→液氮保存”的緩慢降溫法相比，程序降溫凍存盒使用方便，避免了過(guò)多人為操作因素的影響。將細(xì)胞從液氮取出后在水浴鍋中立即融化，以實(shí)現(xiàn)“快融”，使細(xì)胞外冰晶迅速融化后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此方法使復(fù)蘇后細(xì)胞存活率高，均達(dá)90%以上。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)描繪hADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，凍存前后細(xì)胞增殖能力未發(fā)生明顯變化，凍存對(duì)細(xì)胞增殖未產(chǎn)生較大影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子，顯示凍存前后細(xì)胞均有 CD44、CD105、CD29、CD73高表達(dá)，CD31表達(dá)水平很低，HLA－DR幾乎不表達(dá)。CD44、CD105、CD29、CD73是基質(zhì)細(xì)胞的基本分子標(biāo)記，hADSCs呈高表達(dá)；CD31為內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)記，hADSCs表達(dá)陰性［9］。hADSCs在未受刺激的狀態(tài)下不表達(dá)HLA－DR，但在INF－γ刺激時(shí)表達(dá) HLA－DR［1］。本實(shí)驗(yàn)取未受任何刺激的hADSCs檢測(cè)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。MSCs沒(méi)有特殊的表面標(biāo)記，一般認(rèn)為，長(zhǎng)梭形貼壁細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)CD44、CD105、CD29、CD73等表面分子，不表達(dá)CD31、HLA－DR等表面分子，可基本判定為 MSCs［10］。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功分離出hADSCs，建立了將細(xì)胞長(zhǎng)期凍存的方法，細(xì)胞復(fù)蘇后仍具有良好的增殖能力，生物學(xué)性狀未改變，這可能為hADSCs的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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