余軍軍，章 敏，陳綺嫻，寧 軍，韋 田，覃健萍

(廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興527439)

替米考星是由泰樂(lè)菌素的一種水解產(chǎn)物半合成的畜禽專用抗生素，該藥首先由英國(guó)ELanco動(dòng)物保健品公司在20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)成功，目前我國(guó)農(nóng)業(yè)部已批準(zhǔn)替米考星原料、預(yù)混劑、溶液劑和注射液的生產(chǎn)[1-2]。替米考星為廣譜抗菌藥，臨床主要用于治療牛[3]、山羊[4]、豬[5]、雞等動(dòng)物因敏感菌引起的疾病，尤其對(duì)呼吸道感染效果更為明顯，其對(duì)胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿棒狀桿菌及畜禽霉形體等具有比泰樂(lè)菌素更強(qiáng)的活性[6]。同時(shí)，替米考星具有肝、腎毒性，并可損害人體前庭和耳蝸神經(jīng)，長(zhǎng)期使用會(huì)引起耐藥性的產(chǎn)生。因此，我國(guó)對(duì)雞體內(nèi)替米考星的最高殘留限量做了嚴(yán)格規(guī)定[7]。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)替米考星殘留代謝消除規(guī)律的研究報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)多以白羽肉雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于禽品種多樣性而使抗生素休藥期應(yīng)用范圍產(chǎn)生局限性。為了對(duì)其在黃羽肉雞體內(nèi)的殘留消除進(jìn)行了解，以便更好地使用該藥防治動(dòng)物疾病，同時(shí)為制定對(duì)人類安全的休藥期提供可靠的依據(jù)，特進(jìn)行了本次試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和溶液 替米考星對(duì)照品(純度98.0%，Lot:00608，德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司)。替米考星儲(chǔ)備液(1 mg/mL)，準(zhǔn)確稱量約50 mg替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，置50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，密封，置-20℃冰箱中保存。使用時(shí)配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。甲醇、乙腈、甲酸、正己烷等均為色譜純，德國(guó)默克公司。

1.2 儀器設(shè)備 液質(zhì)聯(lián)用儀，Agilent1200液相系統(tǒng)和QQQ6410B三重四級(jí)桿質(zhì)譜串聯(lián)組成;組織勻漿機(jī)，JZ-Ⅱ型，天津四方電器設(shè)備廠;氮吹儀，UGC-24M型，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;微量分析天平，BT125D，德國(guó)賽多利斯;高速離心機(jī)，5804R，德國(guó) Eppendorf;C18 SPE 小柱，5 mL/1g，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及用藥 供試雞為4種優(yōu)質(zhì)肉雞(矮腳黃雞、竹絲雞、天露草雞、天露黑雞)，40日齡，體重在1.5～2 kg之間，每一品種肉雞50只，共計(jì)200只，由集團(tuán)技術(shù)中心試驗(yàn)肉雞場(chǎng)提供，自由飲水、采食。試驗(yàn)前，飼喂5日不含藥物的全價(jià)飼料，觀察雞只健康。連續(xù)飼喂添加200 mg/kg替米考星含量的全價(jià)飼料5 d，然后改投不含藥物的飼料。同時(shí)，每一品種分出10只對(duì)照雞，飼喂不含替米考星的全價(jià)飼料。分別在停藥后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 處死試驗(yàn)雞，每時(shí)間點(diǎn)每一品種處死5只雞，摘取肝臟、雞肉冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 飼料的配制 20%替米考星可溶性粉，批號(hào)12111001，購(gòu)于西安樂(lè)道生物科技有限公司。使用前按上述劑量添加到全價(jià)飼料中并混勻，即200 g可溶性粉拌料200 kg飼料。

1.5 檢測(cè)條件 液相條件:色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，3.0 mm ×100 mm，1.8 μm;流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液∶0.2%甲酸乙腈溶液(30∶70);流速0.25 mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，毛細(xì)管電壓4000 V，霧化器壓力25 psi，霧化器流速10 L/min，離子源溫度350℃。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一定量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用30%乙腈水依次稀釋成 10、50、100、200、500、1000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 樣品處理 稱取(4±0.04)g已勻漿試樣置于50 mL聚丙乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，10000 r/min 漩渦30 s，300 r/min 振蕩15 min，4500 r/min離心5 min，上清液移入50 mL離心管中，用10 mL乙腈重復(fù)提取殘?jiān)?，合并上清液。? mL提取液，40℃下氮?dú)獯抵两?，加? mL 20%乙腈水溶液，5 mL正己烷漩渦混勻后離心。下層液體進(jìn)一步用5 mL甲醇活化的C18小柱凈化，用5 mL 20%乙腈水洗滌，5%的氨甲醇6 mL洗脫，收集洗脫液，40℃下吹干，殘?jiān)? mL 30%乙腈水溶解，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.8 檢測(cè)限和定量限 取空白的雞肌肉、肝臟組織，5個(gè)平行，分別按上述樣品處理方法處理樣品。測(cè)得基線噪音值，按3信噪比計(jì)算檢測(cè)限，10倍信噪比計(jì)算定量限。

1.9 回收率和精密度 分別取空白的肌肉、肝臟組織，添加質(zhì)量濃度為0.5、5、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液 100 μL，制得低、中、高 3 個(gè)濃度(12.5、125、500 μg/kg)樣品，按1.7項(xiàng)樣品處理方法分別處理，分別取5 μL測(cè)定，計(jì)算回收率;每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣品，連做3 d進(jìn)行精密度統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍 濃度為10～1000 μg/L范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)，其線性方程為:Y=105327X，R=0.9998。在分析樣品時(shí)，按低濃度到高濃度進(jìn)行，當(dāng)濃度超出此范圍，則稀釋樣品即可。

2.2 質(zhì)譜條件 用適宜濃度1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)質(zhì)譜，在文獻(xiàn)報(bào)道條件[8-9]的基礎(chǔ)上使用安捷倫Masshunter Optimizer質(zhì)譜參數(shù)自動(dòng)優(yōu)化軟件優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，以得到最佳的檢測(cè)條件，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 替米考星的MRM離子對(duì)及質(zhì)譜條件參數(shù)

2.3 檢測(cè)限與定量限 按5個(gè)空白樣品的基線噪音值求其平均值，按3倍信噪比S/N計(jì)算檢測(cè)限、10倍信噪比S/N計(jì)算定量限，得雞肌肉、肝臟組織中替米考星的檢測(cè)限和定量限分別為0.5 μg/kg、1 μg/kg。

2.4 回收率與變異系數(shù) 替米考星在12.5、125、500 μg/kg 3個(gè)添加水平上，平均回收率為:肌肉76.35% ～94.36%，肝臟81.25% ～102.73%，變異系數(shù)范圍在2.3% ～13.4%(n=5)之間。

2.5 殘留消除規(guī)律 雞各組織中替米考星平均殘留量見(jiàn)表2。從表2可以看出，替米考星在肝臟中殘留最高，肌肉中較低，此結(jié)果同李建成等[10]報(bào)道的結(jié)果類似。消除曲線見(jiàn)圖1-圖4，由圖可見(jiàn)，替米考星預(yù)混劑在肌肉、肝臟中消除速率相似，且4個(gè)肉雞品種體內(nèi)消除規(guī)律具有相似性。在停藥10 d后肌肉、肝臟中替米考星原型已基本低于最高殘留限量(肌肉75 μg/kg、肝臟1000 μg/kg)。

表2 連續(xù)飼喂5 d后肉雞肌肉、肝臟中替米考星原型平均含量(n=5)

圖1 替米考星在肉雞組織中的消除曲線

2.6 休藥期 農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[7]規(guī)定了替米考星在肉雞肌肉、肝臟的最大殘留量分別為75 μg/kg和1000 μg/kg。用休藥期計(jì)算軟件WT1.4計(jì)算替米考星在四個(gè)品種肉雞的休藥期分別為:竹絲雞18 d、矮腳黃雞17 d、天露草雞19 d、山坑鳳20 d。

3 討論與小結(jié)

在獸藥組織殘留消除規(guī)律研究中，組織藥物濃度檢測(cè)方法的選擇至關(guān)重要，并且必須于研究開(kāi)始前選擇和確證?；诟咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法的高特異性、準(zhǔn)確性和精密度，本研究選擇高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)作為組織藥物濃度測(cè)定方法。本研究在參考文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，建立了組織中替米考星的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，回收率均在70%以上，批內(nèi)及批間相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，說(shuō)明該方法有良好的精密度，能夠滿足檢測(cè)組織中替米考星殘留的條件，與文獻(xiàn)報(bào)道值[8-9]相符。

整個(gè)替米考星消除過(guò)程中，4個(gè)品種肉雞肝臟中替米考星濃度均高于肌肉，且肝臟與肌肉組織中替米考星消除速率相似，表明肝臟可以作為主要?dú)埩羝鞴儆?jì)算休藥期。同時(shí)，在停藥10 d后肌肉、肝臟中替米考星原型已基本低于最高殘留限量，這些結(jié)果均與李建成等[10]報(bào)道相同，說(shuō)明替米考星可溶性粉在黃羽肉雞與白羽肉雞體內(nèi)的殘留消除規(guī)律具有相似性。

休藥期是指食品動(dòng)物從停止給藥到允許動(dòng)物屠宰或其產(chǎn)品上市的間隔時(shí)間。賈柱等[11]提到，農(nóng)業(yè)部第278號(hào)公告中規(guī)定了一些藥物的休藥期，但其依據(jù)是國(guó)外的資料，各種藥物由于劑型或處方的不同以及動(dòng)物本身的差異，在體內(nèi)的代謝消除情況也存在較大的差異，因此必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出數(shù)據(jù)，并利用軟件計(jì)算出恰當(dāng)?shù)男菟幤?。WT1.4是一個(gè)根據(jù)德國(guó)和獸醫(yī)產(chǎn)品委員會(huì)制定的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)計(jì)算休藥期的軟件，在計(jì)算休藥期過(guò)程中，確保有95%的可信限并使99%的殘留數(shù)據(jù)低于MRLs，從而充分考慮了用藥群體及動(dòng)物品種差異。李建成等[10]以組織中藥物濃度低于最高殘留限量的最短停藥天數(shù)作為藥物在肉雞體內(nèi)的休藥期，得出替米考星在肉雞體內(nèi)休藥期為11 d，這種算法只利用了停藥11 d后組織中平均藥物濃度，并未利用肉雞停藥后替米考星殘留消除規(guī)律，缺乏對(duì)肉雞品種和個(gè)體影響休藥期等方面的考慮。

常規(guī)飼養(yǎng)條件下，以200 mg/kg替米考星劑量水平添加到飼料中飼喂4種黃羽肉雞，連續(xù)飼喂5 d后，休藥第10天時(shí)，肉雞肝臟和肌肉中替米考星殘留量均低于 MRLs(肝臟 1000 μg/kg、肌肉75 μg/kg)。根據(jù)我國(guó)和歐盟藥品管理局(EMEA)規(guī)定的替米考星藥物在肉雞組織中的MRLs標(biāo)準(zhǔn)，黃羽肉雞按上述方法喂服替米考星后，其休藥期(WDT)分別為矮腳黃雞17 d、天露草雞19 d、山坑鳳20 d。為確保食品安全系數(shù)更高，建議替米考星在黃羽肉雞體內(nèi)的休藥期為20 d。

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