賈 英，趙麗霞，馮俊林，李超華，韓四娥

(內(nèi)蒙古金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特010030)

細(xì)胞的最適溫度范圍很小，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適溫度為37℃。絕大部分細(xì)胞的最適生長(zhǎng)溫度是(37±0.5)℃，而細(xì)胞存活的溫度范圍相對(duì)來(lái)說(shuō)大了很多。細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫的耐受力強(qiáng)，降低溫度它們?nèi)阅苌L(zhǎng)，但速度變慢，如細(xì)胞在-196℃能保存數(shù)年甚至更長(zhǎng)時(shí)間[1]。在生產(chǎn)中，有時(shí)會(huì)由于不可控因素導(dǎo)致緊急停產(chǎn)和培養(yǎng)細(xì)胞的短時(shí)間保存，然后需要快速?gòu)?fù)活。與種細(xì)胞常規(guī)復(fù)活方法相比，冷藏保存BHK21細(xì)胞懸液能快速滿足大生產(chǎn)的種細(xì)胞需求，大大縮短了生產(chǎn)啟動(dòng)周期，適合動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)[2]。生產(chǎn)中為了使細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)更好且能夠穩(wěn)定傳代，同時(shí)避免污染或發(fā)生細(xì)胞變異，需要不斷地更換新種子，因此就需要一種快速有效的復(fù)活手段更換現(xiàn)有細(xì)胞，存放懸液無(wú)疑是一種既快又方便的方法[3]。

1 材料與方法

1.1 主要材料 BHK21懸浮細(xì)胞(金宇保靈生物藥品有限公司)，5 L反應(yīng)器(上海傲中)，倒置顯微鏡(XDS-1B)，血球計(jì)數(shù)板(XB-K-25QIUJING)，2～8℃冰箱(中國(guó)海爾)，取樣瓶(SCHOTT 250 mL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 用5 L反應(yīng)器接種BHK21懸浮細(xì)胞，在溫度為37℃、pH為7.1、溶解氧為60%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)到細(xì)胞密度5×106cells/mL左右時(shí)，無(wú)菌分取5個(gè)樣品于滅菌的50 mL取樣瓶中，每瓶30 mL，第一瓶為細(xì)胞原樣(記為0 h)，檢測(cè)細(xì)胞密度和細(xì)胞活力，其余樣品置于2～8℃冰箱中短期靜置保存。在24、48、72、96 h分別取一個(gè)樣品，檢測(cè)細(xì)胞密度和細(xì)胞活力。本實(shí)驗(yàn)用同樣的方法重復(fù)10次。檢測(cè)數(shù)據(jù)分別繪制曲線圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

用1.2項(xiàng)的方法進(jìn)行了10次實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)每次實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞密度和細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞密度和細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果

2.1 繪制曲線圖 分別繪制細(xì)胞密度與細(xì)胞活力曲線圖(圖1、圖2)，曲線圖顯示每個(gè)批次的不同時(shí)間段樣品的檢測(cè)值變化不大，細(xì)胞密度與細(xì)胞活力沒(méi)有隨保存時(shí)長(zhǎng)發(fā)生大的變化，趨勢(shì)線似為平行直線，初步判斷在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞密度和細(xì)胞活力分別與保存時(shí)長(zhǎng)呈線性相關(guān)。但曲線圖并不能說(shuō)明細(xì)胞密度與保存時(shí)長(zhǎng)或細(xì)胞活力與保存時(shí)長(zhǎng)的線性相關(guān)的緊密程度，故采用統(tǒng)計(jì)學(xué)法進(jìn)一步論證其線性關(guān)系。

圖1 細(xì)胞密度與保存時(shí)長(zhǎng)曲線圖

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 現(xiàn)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的線性相關(guān)系數(shù)法及其公式:和直線回歸方程斜率公式:分別以細(xì)胞活力和細(xì)胞密度為自變量，相應(yīng)保存時(shí)長(zhǎng)為依變量求出樣本的線性相關(guān)系數(shù)r和直線斜率b，具體數(shù)值見(jiàn)表2、表3數(shù)據(jù)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)中相關(guān)性質(zhì)判定時(shí)，相關(guān)系數(shù)r值正時(shí)為正相關(guān)，r值負(fù)時(shí)為負(fù)相關(guān)。而且，按r的絕對(duì)值大小，定0～0.33為弱相關(guān)，0.33～0.66為中等相關(guān)，0.66～1為強(qiáng)相關(guān)。

圖2 細(xì)胞活力與保存時(shí)長(zhǎng)曲線圖

表2 細(xì)胞活力對(duì)保存時(shí)長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)與直線斜率數(shù)據(jù)表

表3 細(xì)胞密度對(duì)保存時(shí)長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)與直線斜率數(shù)據(jù)表

表2、表3中的樣品r值代表了細(xì)胞活力(細(xì)胞密度)與細(xì)胞保存時(shí)間這兩個(gè)變量的相關(guān)緊密程度，數(shù)據(jù)表明這兩個(gè)變量的相關(guān)程度在中等相關(guān)以上。而表2、表3中的樣品b值是代表兩個(gè)變量呈線性相關(guān)時(shí)回歸直線的斜率，且樣品b值的絕對(duì)值全部小于0.1，說(shuō)明細(xì)胞活力(細(xì)胞密度)與細(xì)胞保存時(shí)間這兩個(gè)變量的回歸直線基本為水平直線。

3 討論與結(jié)論

首先對(duì)細(xì)胞活力的10個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行直線相關(guān)性求解，求得相關(guān)系數(shù)中除了S101和S106兩個(gè)樣本為弱相關(guān)，其余八個(gè)樣本為線性強(qiáng)相關(guān)，也就是說(shuō)80%的樣本為線性強(qiáng)相關(guān)，說(shuō)明細(xì)胞在2～8℃條件下保存時(shí)，細(xì)胞活力與保存時(shí)長(zhǎng)呈線性規(guī)律。從直線斜率上分析，10個(gè)樣本的直線斜率絕對(duì)值全部小于0.06，基本可視為水平直線，說(shuō)明樣品中細(xì)胞活力沒(méi)有隨保存時(shí)長(zhǎng)的增加而發(fā)生變化。

其次對(duì)細(xì)胞密度的10個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行直線相關(guān)性求解，求得相關(guān)系數(shù)中60%為線性中等相關(guān)，40%為線性弱相關(guān)，但在60%為線性中等相關(guān)的樣品中，直線斜率絕對(duì)值全部小于0.001，可視為水平直線。又因?yàn)樵诩?xì)胞計(jì)數(shù)中存在點(diǎn)樣、計(jì)數(shù)、稀釋等誤差，很小的數(shù)值誤差就會(huì)形成大的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差，所以對(duì)細(xì)胞密度來(lái)說(shuō)，也可認(rèn)為在平溫保存過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生降低現(xiàn)象。在生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一般懸浮細(xì)胞的生產(chǎn)周期為48～72 h，而病毒繁殖周期也在10～24 h左右，所以此次研究偏重于生產(chǎn)，只在96 h時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行了試驗(yàn)。

在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中，細(xì)胞的保存與培養(yǎng)起著同等重要的作用。細(xì)胞在中長(zhǎng)期保存普遍采用-79℃超低溫冰柜或-196℃液氮保存。但BHK21懸浮細(xì)胞在96 h內(nèi)短期保存時(shí)，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，在2～8℃條件下細(xì)胞活力和密度不受影響，細(xì)胞不會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加而出現(xiàn)活力降低或死亡現(xiàn)象。因此，如果短時(shí)間內(nèi)對(duì)BHK21懸浮細(xì)胞進(jìn)行保存時(shí)，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)還是生產(chǎn)，無(wú)論是便于操作還是利于細(xì)胞生存，2～8℃是一個(gè)最適的保存溫度。

[1]張?jiān)d，易小萍，張 立，等.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:224-225.

[2]范田梅，井蓮娜，趙海源，等.冷藏保存BHK21細(xì)胞懸液及復(fù)蘇試驗(yàn)[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44(3):41-44.

[3]羅燕雯，王玉智，陳興芳，等.不同溫度保存BHK21細(xì)胞和IBRS2細(xì)胞試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，37(12):57-58.