趙 卓，胡義彬，潘延缽，賀亞奇，鄧玉芹，王 力，2(.北京生泰爾生物科技有限公司，北京昌平02206;2.北京華夏興洋生物科技有限公司，北京大興02629)

牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)是引起牛的一種急性熱性接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、鼻炎和上呼吸道炎癥為特征。該病在世界各地普遍存在，主要的經(jīng)濟(jì)損失在于延緩肥育牛的生長和增重，患病奶牛產(chǎn)乳量下降，繼發(fā)流產(chǎn)，其流產(chǎn)率有時(shí)高達(dá)50%，急性發(fā)病期牛死亡率可達(dá)10%[1]。文獻(xiàn)報(bào)道我國大部分地區(qū)也存在該病的流行，并由疑似病例中成功分離到了IBR病毒[2-4]，但很多牛場(chǎng)仍缺乏對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病的足夠認(rèn)識(shí)?？刂票静〉闹饕胧┰谟趹?yīng)用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防接種。但在我國，目前尚無IBR疫苗產(chǎn)品上市。本研究成功分離到了一株免疫原性良好的牛傳染性鼻氣管炎病毒，并采用該毒株進(jìn)行了滅活疫苗的初步研究。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料 疑似發(fā)病牛眼鼻分泌物及生殖道分泌物。

1.2 細(xì)胞、抗原及血清 MDBK細(xì)胞、IBRV中和試驗(yàn)抗原、IBR陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1～3月齡IBR中和抗體≤1∶2的健康犢牛25頭，購自北京市北郊奶牛場(chǎng)。體重為

1.5 ～2 kg日本大耳白家兔20只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基，GBICO公司;胎牛血清，蘭州民海生物工程有限公司;Taq聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成;疫苗佐劑(603佐劑)，由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

1.5 儀器設(shè)備 PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡，由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病料采集與處理 選取表現(xiàn)典型IBR臨床癥狀的5頭牛，分別采集鼻腔拭子和生殖道分泌物拭子，放入運(yùn)輸培養(yǎng)液中(含1000單位/mL青霉素、1000 μg/mL鏈霉素和20%血清的DMEM)，4℃作用過夜。凍融2次后，10000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔慮膜進(jìn)行慮過除菌，-20℃保存。

2.2 病毒分離 取上清液1 mL接種于長滿MDBK細(xì)胞單層的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃吸附1 h，傾去液體，加入維持液(含青霉素200單位/mL、鏈霉素200 μg/mL和2%血清的DMEM)，于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，待70% ～80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，如果細(xì)胞不出現(xiàn)CPE，5 d后盲傳，連續(xù)盲傳3代。

2.3 病毒蝕斑克隆純化 將病毒培養(yǎng)液做10倍系列稀釋到10-6，接種長成良好的MDBK細(xì)胞單層的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板;每孔接種病毒稀釋液200 μL，每個(gè)稀釋度病毒液接種2孔，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，每20 min搖動(dòng)一次使病毒分布均勻;吸附后棄去6孔板內(nèi)病毒液;然后取細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的1%瓊脂(60℃水浴加熱)中，混勻，冷卻到40℃時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2～3 mL，凝固后置37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);待適當(dāng)稀釋度出現(xiàn)單個(gè)蝕斑后，吸取噬斑處瓊脂加入營養(yǎng)液中使其溶解后作為收獲病毒，收獲后的病毒液接種單層MDBK細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)增殖。

2.4 病毒TCID50的測(cè)定 待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的MDBK細(xì)胞長滿單層后，將病毒做10倍系列稀釋后，每一稀釋度接種8孔，0.1 mL/孔，37℃吸附1小時(shí)，補(bǔ)加細(xì)胞維持液，0.1 mL/孔。培養(yǎng)板置37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察7 d后，采用Reed-Muench法，計(jì)算IBR病毒TCID50。

2.5 血清中和試驗(yàn) 將IBRV陽性血清于56℃滅活30 min后，作連續(xù)2倍倍比稀釋后，加入等體積的IBR病毒(200 TCID50/0.1mL)，37℃中和1 h。然后將血清-病毒中和液加入長滿單層MDBK細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)血清稀釋度接種4孔，每孔0.2 mL。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變。

2.6 PCR檢測(cè)

2.6.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank中公布的IBRV全基因序列，選取gB蛋白全基因組序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)如下引物序列進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增:

gb-F:5’-CGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACG-3’

gb-R:5’-GCACCCGAACTGCCCATACATAG-3’

2.6.2 病毒DNA的提取 將病毒培養(yǎng)物凍融2～3 次后，取560 μL 加入30 μL 100 g/L SDS和3 μL 20 g/L蛋白酶K，37℃水浴60 min，先后以酚/氯仿和氯仿各抽提1次，0.8倍體積異丙醇沉淀，700 mL/L乙醇洗滌，干燥后加適量無核酸酶水溶解。

2.6.3 PCR擴(kuò)增 50 μL反應(yīng)體系中加入10×Ex Taq buffer 5 μL、dNTP(各 2.5 mmol/L)4 μL、MgCl2(25 mmol/L)4 μL、引物(20 μmol/L)各0.5 μL、Ex TaqTM 酶 0.25 μL、病毒 DNA 2 μL、ddH2O至50 μL。瞬間離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)MDBK細(xì)胞DNA和無DNA的空白對(duì)照。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃ 1 min，65℃45 s，72 ℃ 45 s，10 個(gè)循環(huán);95 ℃ 1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，15個(gè)循環(huán);95 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃45 s，10個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

2.6.4 目的片段測(cè)序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)測(cè)序結(jié)果做進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選用IBR抗體陰性牛5頭，其中3頭采用滴鼻和噴霧的方式共接種IBRV液10 mL(含107.3TCID50)，每天測(cè)定體溫，觀察臨床癥狀。另2頭作為空白對(duì)照組，試驗(yàn)組與對(duì)照組隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)牛出現(xiàn)典型的臨床癥狀時(shí)，采集眼鼻或陰道分泌物進(jìn)行病毒分離和PCR檢測(cè)，發(fā)病后3～5 d撲殺作病理解剖學(xué)觀察。

2.8 疫苗的制備 將IBRV進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，進(jìn)行病毒含量測(cè)定和無菌檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后進(jìn)行病毒滅活。然后將病毒滅活液與603佐劑按照2∶1的比例混合、攪拌均勻。

2.9 疫苗的檢驗(yàn)

2.9.1 常規(guī)檢驗(yàn) 按照現(xiàn)行《中國獸藥典》的方法分別進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、黏度檢驗(yàn)、甲醛殘留檢驗(yàn)[5]。

2.9.2 小白鼠安全性檢驗(yàn) 每批疫苗經(jīng)背部皮下接種IBR滅活疫苗0.3 mL，每組10只，觀察14 d，記錄小白鼠的死亡情況及全身和局部的不良反應(yīng)。

2.9.3 效力檢驗(yàn) 每批IBR滅活疫苗免疫接種5頭牛，每頭牛肌肉注射2 mL，21 d加強(qiáng)免疫一次。同時(shí)每批疫苗免疫接種家兔5只，每只肌肉注射0.5 mL，21 d以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。二免后14 d采血，分離血清，進(jìn)行血清中和抗體測(cè)定。

2.9.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn) IBR滅活疫苗二免后14 d進(jìn)行采血后，隨即連同對(duì)照牛進(jìn)行攻毒，每頭牛采用滴鼻的方法接種F4代牛傳染性鼻氣管炎病毒10 mL(含107.3TCID50)，攻毒后每天觀察臨床癥狀和體溫變化，觀察15 d。根據(jù)牛的發(fā)病情況計(jì)算免疫牛的攻毒保護(hù)率。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離和TCID50測(cè)定 采集疑似發(fā)病牛鼻腔拭子和生殖道分泌物拭子樣品接種MDBK細(xì)胞后，其中1份樣品在第1代的第3天出現(xiàn)死亡細(xì)胞明顯增多的現(xiàn)象，而對(duì)照細(xì)胞生長良好(圖1);傳至第2代，在第2天觀察到特異性CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮，聚集，在單層細(xì)胞上形成空洞，之后細(xì)胞脫落(圖2)，第3天70% ～80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE，細(xì)胞圓縮、死亡、脫落。病毒培養(yǎng)物經(jīng)蝕斑純化后連續(xù)傳3代，CPE出現(xiàn)的時(shí)間和病變特征與前幾代相似。收獲蝕斑純化后的第3代病毒培養(yǎng)物，凍融1次，分裝，經(jīng)TCID50測(cè)定，病毒毒價(jià)為107.7TCID50/mL。

3.2 病毒蝕斑克隆純化 將第2代病毒培養(yǎng)物進(jìn)行病毒蝕斑純化，結(jié)果在第4天即可看到典型的病毒蝕斑(圖3)，吸取蝕斑處瓊脂收獲病毒，收獲后的病毒液接種單層 MDBK細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)增殖，在MDBK單層細(xì)胞上仍可出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)。

3.3 血清中和試驗(yàn) 陽性血清做1∶16倍稀釋后可以與IBR病毒培養(yǎng)物完全中和，MDBK細(xì)胞對(duì)照無細(xì)胞病變產(chǎn)生。而32倍稀釋的血清與病毒中和后有1/4孔細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞呈現(xiàn)園縮聚集成團(tuán)，細(xì)胞間出現(xiàn)空洞，最后圓縮脫落。

3.4 PCR擴(kuò)增 圖4結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)物和IBRV標(biāo)準(zhǔn)株均能擴(kuò)增出與目的基因片段大小一致的特異性條帶。

圖4 IBRV特異性片斷基因擴(kuò)增結(jié)果

3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用序列分析軟件分析，并將測(cè)序序列與GenBank中的牛IBR病毒基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，基因序列同源性達(dá)99%。

3.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 3頭犢牛在攻毒后24 h出現(xiàn)發(fā)熱，溫度達(dá)到40.9℃;攻毒后3 d，3頭牛均出現(xiàn)鼻鏡潮紅，流淚，精神萎靡，食欲減退的癥狀;觀察至第5天，牛的鼻腔及眼角有多量的濃性分泌物，出現(xiàn)咳嗽、拒食、發(fā)熱等典型癥狀，與IBR臨床癥狀相符。其中1頭牛在攻毒后20 d臨床癥狀逐漸減輕，食欲逐漸恢復(fù)。另外一頭牛進(jìn)行剖檢觀察，可見氣管出血，粘膜脫落，牛鼻腔中充滿了膿性分泌物，堵塞整個(gè)鼻道。

3.7 病毒分離與PCR檢測(cè) 結(jié)果顯示，分離物在MDBK細(xì)胞上能產(chǎn)生典型細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒培養(yǎng)物PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽性，確診為IBR病毒感染發(fā)病。

3.8 疫苗的制備和檢驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)室制備的三批IBR滅活疫苗分別進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn)。表1結(jié)果表明，采用603佐劑制備的IBR滅活疫苗性狀良好、穩(wěn)定性好、黏度低、對(duì)小白鼠安全。

3.9 疫苗效力檢驗(yàn) 將制備的三批滅活疫苗分別免疫抗體陰性牛，并對(duì)免疫牛進(jìn)行IBR病毒攻毒試驗(yàn)和中和抗體效檢測(cè)定。表2結(jié)果表明，免疫后IBR中和抗體效價(jià)較高，抗體效價(jià)幾何平均值可達(dá)1∶41以上，攻毒后免疫組牛均無IBR臨床癥狀，可達(dá)5/5保護(hù)。而對(duì)照組牛出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，持續(xù)高溫3 d以上，鼻鏡潮紅，流淚，眼睛有濃性分泌物，食欲減退等癥狀，剖檢后觀察可見對(duì)照組牛的鼻腔內(nèi)有膿性分泌物，靠近肺端氣管有大量的白色泡沫等病理變化。免疫家兔后抗體效價(jià)幾何平均值也可達(dá)1∶42以上，初步表明牛和家兔二者抗體效價(jià)存在一定的平行性。

表1 三批IBR滅活疫苗各項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果

表2 三批IBR滅活疫苗免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

4 小結(jié)

本研究采用MDBK細(xì)胞成功從疑似病例牛的鼻腔分泌物、陰道分泌物拭子中分離出IBR病毒。病毒在MDBK細(xì)胞上可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，且能被IBR陽性血清完全中和。采用特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增出特異性目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序與已發(fā)表的IBRV基因組序列一致。結(jié)果表明分離株為IBR病毒，從而也進(jìn)一步證實(shí)了本病在我國的存在。

國外采用IBR滅活疫苗防控本病取得了很好的效果[6-7]，但在國內(nèi)該疫苗的研制尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段[8]。本研究制備的IBR滅活疫苗免疫抗體陰性牛，中和抗體效價(jià)平均值可達(dá)1∶41以上，高于美國聯(lián)邦法規(guī)(9CFR)標(biāo)準(zhǔn)(≥1∶8)，證明疫苗免疫效果理想，為下一步開展IBR滅活疫苗新產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1]王家駒，李亞明.牛傳染性鼻氣管炎的研究[J].中國畜禽，1994，76(3):1-3.

[2]封啟民.我國牛傳染性鼻氣管炎血清抗體普查報(bào)告[J].動(dòng)物檢疫，1982，(1):36-39.

[3]王淑娟，孫成友，宋曉暉.牛傳染性鼻氣管炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及防控[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2012，28(9):95-96.

[4]徐曉琴，冷 血，李真光，等.牛傳染性 鼻氣管炎病毒IBRV-LN01/08株的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40(4):352-356.

[5]中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部[S].

[6]Pospisil Z，Krejci J，Jinek P，et al.Development of a disease control programe based on the use of an inactivated vaccine against infectious bovine rhinotracheitis[J]. Veterinary Micrology，1996，53:199-206.

[7]Patel J R.Relative efficacy of inactivated bovine herpesvirus-1(BHV-1)vaccines[J].Vaccine，2005，23:4054–4061.

[8]冷 血，趙炳武，郭 利，等.牛傳染性鼻氣管炎滅活疫苗的安全性和免疫保護(hù)效果[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40(11):1161-1165.