王靈娟，高雪麗，隋 欣，于志強，李博韜，鄭世民

（東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

傳染性囊病（IBD）是由傳染性囊病病毒（IBDV）引起的3～12周齡雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染性疾病，其中3～6周齡雞最易感。IBDV主要侵襲雞和火雞的中樞免疫器官－腔上囊，在含有IgM的B淋巴細胞中復制，引起雛雞腔上囊淋巴細胞壞死和淋巴濾泡缺失，腔上囊萎縮，導致雛雞體液免疫功能顯著降低［1］。T淋巴細胞雖然不是IBDV復制的主要靶細胞，但病毒感染雛雞后，其細胞介導的免疫應答也在一定程度上也受到損害，因此，IBDV 感染后雛雞的體液免疫和細胞免疫功能均下降，引起雞體免疫功能障礙，致使感染雛雞對各種疫苗的免疫應答效應降低甚至失敗，誘發(fā)多種疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經濟損失［2］。本試驗應用細胞培養(yǎng)技術和MTT及免疫組織化學方法對SPF雛雞人工感染IBDV后，其免疫器官的T、B淋巴細胞增殖功能和腔上囊、脾臟中IgG、IgA、IgM生成細胞數(shù)的動態(tài)變化進行了較系統(tǒng)的檢測，為進一步探討IBDV感染對雛雞免疫器官的體液免疫和細胞免疫影響，并闡明其發(fā)生機制提供了科學試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 21日齡CSIRO－MVS品種SPF雛雞100只，購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF雛雞實驗動物中心并提供飼養(yǎng)。

1.2 IBDV毒株 IBDV強毒（J1C7）株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑 刀豆蛋白A（ConA）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、脂多糖（LPS）均為Sigma公司產品；二甲基亞砜（DMSO）為 Amresco公司產品；RPMI1640為GICBO公司產品；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.4 實驗動物分組、處理及被檢材料采取 100只21日齡SPF雛雞隨機分為病毒感染組（I組）和對照組（C組）。其中I組雛雞經滴鼻、點眼感染IBDV稀釋液0.1mL／只；C組雛雞經上述相同途徑應用等量高壓滅菌的PBS。兩組雛雞分別于感染后1、3、5、7、14d和28d，每組隨機抽取5只雛雞心臟采血處死，快速采取腔上囊、脾臟和胸腺，做相應處理，供各項檢測指標使用。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 T、B淋巴細胞增殖功能的檢測，采用細胞培養(yǎng)及MTT檢測法。

1.5.2 IgG、IgM、IgA 生成細胞數(shù)量檢測，采用組織切片及免疫組織化學染色法。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，比較兩組間差異，結果均以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 IBDV感染對SPF雛雞免疫器官T、B淋巴細胞增殖功能的影響

表1 IBDV感染SPF雛雞胸腺和脾臟T細胞增殖功能的動態(tài)變化 （590nm OD值）

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其胸腺和脾臟T淋巴細胞增殖功能均于病毒感染后3～7d明顯低于對照雛雞（P＜0.05），其余雖然病毒感染雛雞較對照雛雞有所降低，但未見統(tǒng)計學差異（表1）。

表2 IBDV感染SPF雛雞腔上囊和脾臟B淋巴細胞增殖功能的動態(tài)變化

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊和脾臟中B淋巴細胞增殖功能于病毒感染后3～28d極顯著降低（P＜0.01），其余未見統(tǒng)計學差異（表2）。

2.2 IBDV感染對SPF雛雞腔上囊和脾臟IgG、IgM、IgA生成細胞數(shù)量的影響。

表3 IBDV感染雛雞腔上囊抗體生成細胞數(shù)量的動態(tài)變化 （×103個／mm2）

表4 IBDV感染雛雞脾臟抗體生成細胞數(shù)量的動態(tài)變化 （×103個／mm2）

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊中IgG、IgA、IgM生成細胞數(shù)均于病毒感染后1～28d均不同程度的低于對照雛雞，其中IgG生成細胞數(shù)量在感染后3～28d極顯著降低（P＜0.01），IgA和IgM生成細胞數(shù)均于感染后5～14d顯著或極顯著低于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01）（表3）。

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其脾臟IgG、IgA、IgM生成細胞數(shù)量均于感染后的28d內低于對照雛雞，其中IgG生成細胞數(shù)于感染后3～7d顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），IgA、IgM生成細胞數(shù)量于感染后3～14d明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）（表4）。

3 討論

細胞免疫主要是T淋巴細胞及相關細胞因子所介導的免疫應答，T細胞在胸腺內分化成熟并隨血液流動至外周淋巴器官的特定部位，發(fā)揮細胞免疫功能，因此，T細胞增殖功能反映機體細胞免疫功能狀態(tài)。T淋巴細胞成熟的特征之一，是對有絲分裂原，如植物凝集素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）等刺激呈現(xiàn)分裂增殖反應［3］，因此，在適宜條件下，通過有絲分裂原誘導離體培養(yǎng)的胸腺、脾臟和腔上囊細胞的增殖反應是研究淋巴細胞分化發(fā)育、免疫功能調節(jié)的方法之一。據(jù)報道，SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊、脾臟、胸腺以及盲腸扁桃體等免疫器官組織受損，對其所含的T淋巴細胞數(shù)量及功能影響顯著［4－5］。肖琛聞等［6］報道，雛雞感染IBDV后3～5d，脾臟和外周血T淋巴細胞增殖功能顯著降低，隨后T淋巴細胞增殖功能又逐漸恢復。本試驗結果顯示，21日齡SPF雛雞胸腺和脾臟T淋巴細胞增殖功能于IBDV感染后3～7d顯著降低，后期逐漸恢復，此研究與肖琛聞等人報道基本一致。IBDV感染雛雞，其T淋巴細胞增殖功能降低的原因是，雛雞感染IBDV后，巨噬細胞誘導T淋巴細胞分泌IL－2的量降低，不能發(fā)揮直接或間接活化T細胞的功能，使其增殖功能降低；一些具有調節(jié)T細胞功能的因子，如IFN－α、β、IL－6和IL－8等能夠增加感染IBDV后雛雞組織的壞死程度，致使淋巴細胞數(shù)量及功能降低；IFN－γ刺激巨噬細胞釋放NO抑制淋巴細胞增殖功能［7］。

體液免疫主要由B淋巴細胞介導，當外界抗原刺激時，B細胞分化為漿細胞，漿細胞產生和分泌特異性抗體，發(fā)揮體液免疫作用。禽體內B細胞產生的抗體主要有IgA、IgM和IgG 3種，具有阻止外來抗原、異物傷害的作用。IBDV的主要靶器官是腔上囊，其中B細胞對IBDV最敏感，帶有sIgM的B細胞為IBDV的重要靶細胞，除腔上囊外，IBDV對其他富含B淋巴細胞的組織器官，如脾臟等，也具有很強的攻擊性，可造成淋巴細胞受損，細胞凋亡，甚至壞死等。IBDV多種蛋白如VP2、VP5均能引起B(yǎng)淋巴細胞凋亡，使?jié){細胞生物轉化受阻，抗體的合成及分泌減少，機體體液免疫受抑制［8－9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，1日齡雛雞感染IBDV后1～6周，腔上囊和脾臟中漿細胞數(shù)量和IgA、IgM和IgG含量均顯著低于對照雛雞［10］。本試驗發(fā)現(xiàn)，21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊和脾臟中B細胞增殖功能和IgA、IgM和IgG生成細胞數(shù)均于病毒感染后1～28d低于對照雛雞；并且，腔上囊和脾臟中B淋巴細胞增殖能力變化與IgA、IgM和IgG生成細胞數(shù)量變化相一致，且持續(xù)時間較長，其可能原因為，雛雞感染IBDV后，B細胞數(shù)量減少，增殖功能降低，導致漿細胞數(shù)量減少，分泌相應抗體下降，體液免疫功能降低。由此可見，SPF雛雞感染IBDV后，引起感染雛雞體液免疫功能下降，導致雛雞抗病能力降低。

綜上可見，B細胞介導的體液免疫與T細胞介導的細胞免疫共同參與IBDV的免疫致病過程，并且IBDV具有抑制雛雞體液免疫和細胞免疫的功能，同時發(fā)現(xiàn)，B細胞增殖功能和抗體生成量降低的持續(xù)時間顯著長于T細胞增殖功能的抑制時間，表明IBDV感染雛雞體液免疫的損害重于細胞免疫。

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