任凌雁，何 燕，張 婷，王嬋娟，官志忠，單可人

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550004）

近年來，利用線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和Y染色體多態(tài)位點(diǎn)對(duì)不同人群進(jìn)行比較，從而使人類進(jìn)化和群體遺傳研究得到較大發(fā)展。人類mtDNA極少發(fā)生重組，有效群體小，能嚴(yán)格的執(zhí)行母系遺傳。單核甘酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphism，SNP)是人類變異最常見的一種，由于其密度高，遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，SNP被認(rèn)為是第三代遺傳標(biāo)記而廣泛應(yīng)用［1］。mtDNA上COⅡ/tRNALys基因間的非編碼區(qū)Ⅴ中存在一個(gè)9 bp序列 (CCCCCTCTA)缺失的多態(tài)位點(diǎn)［2］，研究顯示不同地域人群mtDNA 9 bp缺失頻率有很大差別，是檢測(cè)人類群體多態(tài)性的主要標(biāo)志之一。Y染色體是父系遺傳，并且大部分不發(fā)生重組，是分析人類起源、遷徙的重要工具。其中Y染色體DYS287位點(diǎn)是一個(gè)應(yīng)用廣泛，具有較高研究?jī)r(jià)值的多態(tài)位點(diǎn)，檢測(cè)其陽(yáng)性率可以研究不同民族群體的遺傳關(guān)系。貴州是一個(gè)多民族省份，世居少數(shù)民族達(dá)17個(gè)，本次研究就17個(gè)世居少數(shù)民族中的毛南族、畬族等9個(gè)民族作mtDNA Region V以及Y染色體DYS287位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)，分析這9個(gè)民族群體的遺傳多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

根據(jù)知情同意原則，分別采集貴州平塘毛南族、麻江畬族、黔西仡佬族、麻江仫佬族、威寧回族、剛邊壯族、黔西滿族、石阡蒙古族、江口羌族各60份血液標(biāo)本，采血對(duì)象均3代內(nèi)無族外通婚，彼此間無親緣關(guān)系男性，EDTA·K2抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 按照酚氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA，定量標(biāo)化至100 ng/μL后于－20℃保存。

1.2.2 mtDNA Region V的擴(kuò)增及序列測(cè)定 引物序列:F 5-ACTTTCACCGCTACACGA-3，R 5-ATTTAGTTGGGGCATTTC-3，PCR反應(yīng)體系為 25 μL，包括:10 × PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，TaqDNA聚合酶0.4U(北京天根生化有限公司)，DNA模板100 ng。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。序列測(cè)定交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.3 Y染色體DYS287位點(diǎn)的擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) YAP引物序列F:5’-CAG GGG AAG ATA AAG AAA TA-3’，R:5’-ACT GCT AAA AGG GGA TGG AT-3’，25 μL PCR反應(yīng)體系組成為:10× PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，4×dNTP(每種10 mmol/L)2 μL，引物各 0.5 μL，DNA聚合酶1.0U(北京天根生化有限公司)，模板DNA 100 ng。PCR循環(huán)條件:94℃變性40 s，51℃退火40 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物用w=2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA Region V缺失多態(tài)類型檢測(cè)與分析

在PCR檢測(cè)中未見非特異擴(kuò)增，并且獲得2種帶型，即258(雙拷貝9 bp型)和249 bp(9 bp缺失型)，結(jié)果見圖1。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與相對(duì)應(yīng)的劍橋序列一致，結(jié)果見圖2。檢測(cè)的9個(gè)民族(各60份):仡佬族、畬族、壯族、仫佬族、毛南族、蒙古族、回族、羌族、滿族mtDNA 9 bp缺失個(gè)數(shù)分別為:16、15、11、8、6、5、4、3。

圖3 貴州9個(gè)少數(shù)民族mtDNA Region V缺失頻率比較Fig.3 The comparison of mtDNA Region V deletion in 9 ethnic groups of Guizhou

2.2 Y染色體DYS287多態(tài)類型

在PCR－瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中，未見非特異擴(kuò)增，獲得2種帶型，455 bp(YAP+)和150 bp(YAP－)見圖4，即發(fā)現(xiàn)仡佬族、毛南族分別有12例、1例YAP+，其余民族均為YAP－。

圖4 Y染色體DYS287位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 The results of electrophoresis of PCR products of Y-chromosome DYS287 sites

3 討論

3.1 貴州9個(gè)民族mtDNA的Region V區(qū)9 bp分布特點(diǎn)

mtDNA的Region V區(qū)是位于8272－8289核苷酸之間2個(gè)串聯(lián)的重復(fù)序列，其中一個(gè)由于DNA復(fù)制過程中滑鏈錯(cuò)配而丟失。學(xué)者認(rèn)為9 bp序列的缺失起源于亞洲并且是亞洲人群的特征［3］，并且其分布與種群、地域有關(guān)。就我國(guó)民族9 bp缺失頻率分析，臺(tái)灣漢族9 bp缺失頻率高達(dá)40%［4］，均高于本次研究的9個(gè)民族，而廣州漢族的缺失頻率 (20.8%)［5］與本次研究的蒙古族、回族、羌族、滿族相差較大;西北邊的一些少數(shù)民族，如朝鮮族 (9.43%)、維吾爾族 (3.3%)、塔吉克族 (1.43%)、現(xiàn)代羅布人 (8.3%)［6－9］與本次研究的回族、羌族、滿族、蒙古族的缺失頻率相近，與仡佬族等相差較大。這與姚永剛得出的結(jié)論是一致的。

從貴州世居民族的支系劃分來看，畬族據(jù)記載是屬于瑤族的一個(gè)分支，壯族、仡佬族、仫佬族、毛南族來源于古老的百越部落，其中仡佬族是貴州特有的少數(shù)民族，自商周時(shí)期就有記載。而蒙古族、回族、羌族、滿族則是屬于北方部落的民族。本次研究發(fā)現(xiàn)，起源于百越、苗瑤支系的民族9bp缺失頻率是高于北方起源的民族的。但是同為北方民族的西北蒙古族的缺失頻率 (4%)［4］低于貴州蒙古族，而貴州的滿族與遼寧的滿族 (6.67%)［4］缺失頻率相接近，究其原因可能是這些民族群體在遷徙過程中與其他群體發(fā)生基因融合造成的。

從中國(guó)民族的語(yǔ)系劃分來看，壯語(yǔ)、仫佬語(yǔ)、毛南語(yǔ)、仡佬語(yǔ)屬于壯侗語(yǔ)系;畬語(yǔ)屬于苗瑤語(yǔ)系;蒙古語(yǔ)、滿語(yǔ)屬于阿爾泰語(yǔ)系;羌語(yǔ)屬于漢藏語(yǔ)系;而回語(yǔ)屬于印歐語(yǔ)系。本次研究中，壯族、仫佬族、毛南族、仡佬族9 bp缺失頻率是接近的，畬族與苗瑤語(yǔ)系的苗族如雷山苗族 (25.27%)［10］的缺失頻率也相近，但是同為阿爾泰語(yǔ)系的蒙古族與滿族、同為漢藏語(yǔ)系的羌族與貴州漢族(11.43%)［4］的缺失頻率較大，盡管差異沒有達(dá)到顯著水平。

3.2 貴州9個(gè)民族Y染色體DYS287多態(tài)類型分析

DYS287位點(diǎn)是位于Y染色體長(zhǎng)臂q11的一個(gè)Alu序列插入多態(tài)，是Y染色體特異區(qū)的雙等位基因位點(diǎn)，由于Alu插入事件在進(jìn)化史中僅發(fā)生過一次，故YAP－被認(rèn)為是祖先型［11］，可以用于鑒定穩(wěn)定的遺傳譜系關(guān)系。DYS287位點(diǎn)也是具有地理、種群分布的特異性，不同地區(qū)或者不同民族其DYS287位點(diǎn)的YAP+頻率不同。在我國(guó)藏族人群的 YAP+頻率為 41.5%［12］，普米族更是高達(dá)72.3%［13］，均遠(yuǎn)高于本次研究。不同地區(qū)的同一個(gè)民族其YAP+表現(xiàn)也是有差異的，如蒙古族、回族。內(nèi)蒙古的蒙古族和甘肅回族YAP+頻率分別為4.3%［13］、3.23%［14］，而云南和貴州的蒙古族和回族 YAP+頻率均為0。

從民族起源來看，屬于北方部落的蒙古族、回族、羌族、滿族，他們中回族和滿族在其主要居住地發(fā)現(xiàn)YAP+，但是可能在遷徙過程中YAP+被稀釋以致于遷徙到貴州的民族群體中沒有發(fā)現(xiàn)YAP+;同屬百越系統(tǒng)的壯族、仡佬族、仫佬族、毛南族中，本次研究發(fā)現(xiàn)了仡佬族和毛南族攜帶YAP+，其余民族 YAP+均為零，分析其原因可能是仡佬族和毛南族作為一個(gè)獨(dú)立的群體與當(dāng)時(shí)遷入的南方的漢族群體發(fā)生了基因交流所致，而其他百越系統(tǒng)的民族群體由于其古代部落沒有攜帶YAP+，加上地理環(huán)境與周圍隔絕造成了奠基者效應(yīng)。從語(yǔ)言學(xué)分類上看，蒙古族、滿族的YAP+攜帶率與同屬阿爾泰語(yǔ)系的鄂倫春族［15］、哈薩克族的頻率一樣均為零;毛南族和仫佬族都屬于壯侗語(yǔ)系侗水語(yǔ)支，其親緣關(guān)系應(yīng)該很近，本次研究中毛南族 YAP+的頻率為1.67%，仫佬族未發(fā)現(xiàn)YAP+，可能是由于實(shí)驗(yàn)中抽樣誤差所致。畬族雖然與苗族同屬苗瑤語(yǔ)系，但是各自的YAP+攜帶率是有較大差異的，苗族 YAP+頻率為11.8%［13］，畬族為零，推測(cè)由于奠基者效應(yīng)在本次研究的畬族群體中起到了作用。

總之，通過本次實(shí)驗(yàn)，獲得了貴州9個(gè)世居少數(shù)民族mtDNA Region V以及Y染色體DYS287位點(diǎn)多態(tài)型數(shù)據(jù)，為我省少數(shù)民族的起源及遷徙提供了一定的遺傳背景資料。

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