沈紅霞，韓秀杰，趙凡凡，張保新，余風(fēng)艷，王曉杜

(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱日本腦炎病毒，可引起以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的蟲媒性人畜共患病，即乙型腦炎或日本腦炎。中國乙腦發(fā)病人數(shù)占世界總發(fā)病數(shù)的80%以上[1]。JEV可以感染蚊子Culicidae和豬Sus scrofa domesticus，作為JEV的寄存宿主，豬感染乙腦病毒后表現(xiàn)為繁殖機(jī)能障礙，母豬表現(xiàn)為產(chǎn)死胎、木乃伊胎等。該病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展，也是獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一。JEV屬黃病毒科Flaviviridae黃病毒屬Flavivirus，其基因組為單股、正鏈RNA分子，其長度約為11 kb(10 976 bp)，從5′端96位ATG起始，至3′端10 393位終止，僅形成1個(gè)長約10.3 kb的開放讀碼框架 (ORF)，編碼1個(gè)長為3 432個(gè)氨基酸殘基的蛋白前體，在宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶和病毒蛋白酶的切割下，它產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白(C蛋白、PrM/M和E蛋白)以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b 和 NS5)[2－3]。該病毒經(jīng)過幾十年的進(jìn)化，現(xiàn)存 5 種基因型，整個(gè)亞洲JEV的各種基因型都有流行[4]。其中JEV-NS1基因全長約1 245 bp，預(yù)測分子量為40 kDa左右，由于N端存在糖基化位點(diǎn)，所以在病毒感染細(xì)胞中是分子量為46 kDa的糖蛋白[5]。前體蛋白首先在E-NS1位點(diǎn)裂解后，NS1轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，然后NS1～NS2a位點(diǎn)發(fā)生裂解，產(chǎn)生成熟的NS1[6]。NS1的主要功能是作為病毒RNA復(fù)制的共因子，參與病毒RNA的合成。與此同時(shí)，因它能分泌到胞外，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NS1的抗體，而此抗體能抵抗病毒的感染[7]，所以NS1也與E和M蛋白一樣，作為疫苗開發(fā)的對(duì)象得到廣泛研究。本研究克隆豬日本乙型腦炎的NS1基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌Escherichia coli中大量表達(dá)，并純化該重組蛋白，制備小鼠抗JEV-NS1的抗體，驗(yàn)證抗體的特異性，為探討該蛋白的功能及病毒復(fù)制的相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬日本乙型腦炎病毒SH-JEV01毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所馬志永研究員惠贈(zèng)；BHK-21細(xì)胞，原核表達(dá)載體pET-28(a)、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)為浙江農(nóng)林大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。ICR小鼠Mus musculus購于浙江省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

核酸標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker DL2000)，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq DNA聚合酶等購自大連寶生物公司；T4 DNA ligase購于NEB公司；IPTG和弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購于Sigma公司；Trizol購自invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒購于上海華舜生物公司；A型小量DNA片段快速純化回收試劑盒，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購于axgen生物有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組RNA的提取 將JEV病毒感染的BHK-21細(xì)胞樣品重懸于Trizol試劑中，室溫10 min后，加入1/3體積氯仿，反復(fù)混勻后室溫5 min。以15 000°min－1離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，反復(fù)混勻后室溫沉淀5 min，以15 000°min－1離心15 min。去掉上清液后，用70%的乙醇洗滌沉淀1次，室溫干燥后，溶于適量的RNase free水中，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增JEV-NS1基因 根據(jù)AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的方法，將上面提取的病毒基因組RNA，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此cDNA為模板，JEV-NS1引物上游 F: 5′gcggaattcatggacactggatgtg 3′； JEV-NS1 全長片段下游引物 R1: 5′gcggtcgacttaggcagcgactagc 3′(1～1 254 bp)，JEV-NS1 突變體下游引物 R2: 5′gcggtcgacttacggaagggagcaactg 3′(1～957 bp)，在 PCR 管中加入如下 20 μL 體系: RNAse Free ddH2O 14.3 μL，10×緩沖液 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL，10 μmol°L－1引物各0.4 μL，Taq酶0.3 μL，cDNA模板 1.0 μL；在PCR儀中以下面條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min，最后4℃保存。10.0g°L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.3 pET-28(a)-JEV-NS1重組質(zhì)粒構(gòu)建 將上述膠回收的JEV-NS1的PCR產(chǎn)物和pET-28(a)空質(zhì)粒使用EcoRⅠ，SalⅠ分別進(jìn)行雙酶切，酶切回收后，回收產(chǎn)物在T4連接酶作用下，把JEV-NS1全長和突變體亞克隆到pET-28(a)載體上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取菌落經(jīng)PCR和重組質(zhì)粒雙酶酶切鑒定為陽性者，送上海英駿生物公司測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白JEV-NS1的誘導(dǎo)表達(dá) 上述陽性重組質(zhì)粒pET-28(a)-JEV-NS1和 pET-28(a)-JEV-NS1-mutant轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21(DE3)內(nèi)，挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)期時(shí)加入1.0mmol°L－1的IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)3 h后，取樣并煮沸制備樣品，SDS-PAGE檢測重組JEV-NS1和JEV-NS1-mutant蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 重組蛋白JEV-NS1的純化 將1.2.4鑒定好的表達(dá)JEV-NS1蛋白的陽性克隆擴(kuò)大到100.0 mL進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)期時(shí)，加入1.0 mmol°L－1的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)3 h后，收集菌體，按照王曉杜等[8]方法提取包涵體，溶解好的包涵體按照his-band Ni＋試劑盒說明書方法進(jìn)行純化，純化后蛋白利用透析的方法進(jìn)行復(fù)性，制備大量可溶性的重組JEV-NS1蛋白。聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測該蛋白包涵體提取和純化效果。

1.2.6 多克隆抗體的制備 將純化后的JEV-NS1蛋白與弗氏完全佐劑佐劑混合均勻(1:1)，頸部皮下注射給ICR小鼠(50 μg°只－1)，2周后用弗氏不完全佐劑與蛋白混合后注射，以后隔2周注射1次，共免疫4次后采血，收集血清即為多克隆抗體。用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法測定其效價(jià)。

1.2.7 抗體特異性檢測 根據(jù)王曉杜[9]的方法，分別以原核表達(dá)產(chǎn)物和病毒感染后Vero細(xì)胞的裂解產(chǎn)物作為上樣樣品，進(jìn)行SDS-PAGE，再以制備的小鼠抗JEV-NS1多克隆抗體作為一抗，western-blotting顯色，驗(yàn)證抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 JEV-NS1基因RT-PCR結(jié)果

以1.2.2合成的JEV cDNA為模板，用帶有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的引物，RT-PCR擴(kuò)增JEV-NS1的基因片段，所克隆的片段帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明(圖1)，本研究獲得大小1.3 kb左右的片段，與預(yù)期大小基本一致。

2.2 重組質(zhì)粒pET-28(a)-JEV-NS1的構(gòu)建

用EcoRⅠ和SalⅠ酶分別對(duì)JEV-NS1基因的PCR產(chǎn)物、pET-28(a)空載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化回收后，JEV-NS1基因的PCR產(chǎn)物、pET-28(a)空載體經(jīng)T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，所獲得的重組質(zhì)粒再進(jìn)一步用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳，結(jié)果(圖2)為陽性的細(xì)菌克隆送上海桑尼生物公司測序。測序結(jié)果獲得的序列，經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上Blast比對(duì)，該片段與NCBI上公布的JEV-NS1基因序列同源性高達(dá)99%(GenBank No:AF315119)，說明本研究克隆到了JEV-NS1基因，并且該序列正確插入到pET-28(a)空載體，重組表達(dá)載體pET-28(a)-JEV-NS1構(gòu)建成功。

2.3 重組JEV-NS1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

上述鑒定好的pET-28(a)-JEV-NS1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21(DE3)，挑取2～3個(gè)克隆過夜培養(yǎng)，重新轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，1 mmol°L－1IPTG誘導(dǎo)3 h，在異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后分別取樣，加入1×十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸裂解細(xì)菌，SDSPAGE電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明:重組蛋白JEV-NS1在大腸埃希菌內(nèi)大量表達(dá)(圖3)，利用DNASTAR軟件分析，預(yù)期分子量大小為(40＋8)kDa，結(jié)果表明表達(dá)蛋白大小與預(yù)期一致(48 kDa左右)。薄層掃描分析表明，表達(dá)的重組蛋白占總菌體蛋白的20%以上。利用his-band Ni＋柱純化，只能得到很少的蛋白，不能用于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 JEV-NS1-mutant重組蛋白的表達(dá)和純化

根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)發(fā)現(xiàn)JEV-NS1基因序列中大腸埃希菌稀有密碼子有20個(gè)，特別是從958 bp開始有連續(xù)3個(gè)稀有密碼子，這將限制該基因在大腸埃希菌中的表達(dá)，所以重新設(shè)計(jì)下游引物，按照1.2.3方法構(gòu)建重組pET-28(a)-JEV-NS1-mutant(958～1 245 bp截短)質(zhì)粒(圖4)。重組pET-28(a)-JEV-NS1-mutant質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測表明(圖5)，獲得大小為39 kDa左右的重組蛋白(31 kDa＋8 kDa)，JEV-NS1-mutant蛋白表達(dá)量明顯上升，表達(dá)的重組蛋白占總菌體蛋白的40%以上。經(jīng)his-band Ni＋純化，獲得高純度的重組JEV-NS1-mutant蛋白，占純化后總蛋白的85%以上。

圖1 JEV-NS1基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification of JEVNS1 by RT-PCR

圖2 pET-28(a)-JEV-NS1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 2 Digestion ofrecombinant plasmid pET-28 (a)-JEVNS1 by restrict enzyme

圖3 重組JEV-NS1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Figure 3 Expression of recombinant protein JEV-NS1 by IPTG induction

圖4 pET-28(a)-JEV-NS1-mutant重組質(zhì)粒的構(gòu)建Figure 4 Construction of recombinant plasmid pET-28(a)-JEV-NS1-mutant

圖5 重組JEV-NS1-mutant蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化Figure 5 Expression and purification of recombinant protein JEV-NS1-mutant by IPTG induction

2.5 JEV-NS1免疫原性及抗體特異性鑒定

重組JEV-NS1-mutant蛋白免疫ICR小鼠，制備的小鼠抗JEV-NS1多克隆抗體，其ELISA效價(jià)為2×105。以原核表達(dá)產(chǎn)物(JEV-NS1，JEV-NS1-mutant)進(jìn)行SDS-PAGE，小鼠抗JEV-NS1作為一抗，westernblotting檢測抗體與抗原的反應(yīng)性，結(jié)果表明:抗體能特異的識(shí)別JEV-NS1蛋白和JEV-NS1-mutant蛋白，證明該蛋白具有較好的免疫原性(圖6A)。病毒感染vero細(xì)胞12，24，36，48 h后，收取細(xì)胞樣品，裂解后進(jìn)行SDS-PAGE，以本研究制備的小鼠抗JEV-NS1抗體作為一抗，western-blotting檢測抗體與病毒表達(dá)JEV-NS1蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果表明小鼠抗JEV-NS1抗體能特異識(shí)別病毒表達(dá)的NS1蛋白(圖6B)。

3 討論

JEV病毒的NS1蛋白在黃病毒科家族中具有較高的保守性，它能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是JEV亞單位疫苗的候選者，其DNA疫苗具有較好的免疫保護(hù)能力[10]。有較多的學(xué)者利用各種不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白，一方面可以研究NS1在致病機(jī)制中的作用[7]，另一方面可以建立檢測JEV感染的方法[11]。由于抗NS1抗體能通過Fc受體依賴的途徑引發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫[12]，所以開發(fā)出針對(duì)NS1的許多單克隆抗體用于治療JEV和黃病毒科病毒的感染[13]。

本研究克隆了從豬群中分離的神經(jīng)毒JEV病毒株的NS1基因，該序列與美國國家生物技術(shù)信息中心上公布序列同源性99%以上，在原核表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)重組蛋白JEV-NS1，表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的20%以上，表達(dá)量偏低。由于JEV-NS1基因的958 bp后有連續(xù)3個(gè)稀有密碼子，所以通過突變截短該基因，使得重組蛋白表達(dá)量得到極大提高，經(jīng)純化后達(dá)總蛋白的85%以上。利用高純度的重組JEV-NS1-mutant蛋白免疫IRC小鼠，制備了小鼠抗JEV-NS1抗體，抗體效價(jià)水平較高，特異性也較好，為檢測JEV試劑盒的建立提供工具，也為研究其病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫中的作用和探討其在病毒致病中的機(jī)理打下較好的基礎(chǔ)。JEV引起的母豬繁殖障礙給養(yǎng)豬業(yè)帶來了重大危害，該病在豬群中的發(fā)生具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，因此，監(jiān)測該病的流行情況，控制它在豬群中的擴(kuò)散，研發(fā)抗病毒藥物等措施都有利于該病的防控。

圖6 JEV-NS1抗原性和小鼠抗JEV-NS1抗體特異性驗(yàn)證Figure 6 Immunogenicity of JEV-NS1 and the specificity of mouse anti-JEV-NS1 antibody

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