尹世金，蘭 珍，李羽欣

(中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074)

蝎是生存了4億多年最古老的物種之一［1］，蝎在進(jìn)化中形態(tài)沒有很大變化，這與其有一套用于捕食和防御的有效武器——蝎尾腺分泌的毒液有關(guān).蝎毒素是一類由20～80個氨基酸組成的小肽(2～9Kd)，能夠選擇性地與細(xì)胞膜上的 K+、Na+、Cl-和Ca2+等離子通道結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞對離子的通透能力，進(jìn)而影響動物機(jī)體、組織和細(xì)胞的生理功能［2-7］.作用于K+通道的蝎毒肽是一類由20～40個氨基酸通過3或4個二硫鍵交聯(lián)而成的具有多種生物活性的小分子多肽，它不僅可作為研究相關(guān)的靶離子通道受體調(diào)控胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子探針，還可為構(gòu)建系列肽類藥物提供理想的分子模板［8］.

序列比對分析表明，從海南斑等蝎毒腺分離的Im58多肽是哺乳動物Kv1.3通道的阻斷劑.Kv1.3通道是電壓門控鉀通道Kv1.x亞家族中的一員，它在哺乳動物體內(nèi)分布較廣，主要表達(dá)在腦、肺、胸腺、脾等組織的 T細(xì)胞膜上［9］.當(dāng)人體自身免疫失調(diào)時，體內(nèi)的T細(xì)胞發(fā)生大量的激活，增殖和分化，引起自身免疫疾病.研究表明，Kv1.3通道在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的膜電位及鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著非常重要的作用，T細(xì)胞表面的Kv1.3通道數(shù)目的變化與自身免疫疾病密切相關(guān)［10］.近年來國內(nèi)外正在積極開展自身免疫疾病的治療，研究表明鉀通道Kv1.3可以作為治療自身免疫疾病的藥物靶標(biāo)，研發(fā)靶向鉀通道Kv1.3調(diào)節(jié)劑已成為新型免疫抑制藥物的發(fā)展方向［11］.

在各種有毒動物的天然毒素中，大部分高親和性Kv1.3通道阻斷劑都來自蝎毒素［12］.故以蝎毒肽為基礎(chǔ)篩選與設(shè)計多肽藥物尋找高特異性和選擇性的Kv1.3通道調(diào)節(jié)劑，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值.本研究采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了Kv1.3通道阻斷劑的原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-Im58，表達(dá)、純化和鑒定了新型蝎毒肽Im58，為進(jìn)一步研究Im58的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

表達(dá)質(zhì)粒 PGEX-4T-1、實驗菌株 DH5α、E.coli/Rosetta(DE3)等由武漢大學(xué)病毒及分子癌學(xué)實驗室李文鑫教授課題組提供.限制性內(nèi)切酶 BamHI、XhoI、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、PCR 所用試劑和酶(TakaRa公司，日本)，T4DNA連接酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA Marker(Fermentas公司，加拿大)，質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、小腸激酶(武漢摩爾肽公司)，還原型谷胱甘肽(GSH，武漢眾一生物技術(shù)公司)，小分量蛋白Marker(武漢凌飛生物技術(shù)公司)，10KD截流的超濾管(Milipore公司，德國)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 擴(kuò)增Im58基因序列

從海南斑等蝎的毒腺cDNA文庫中，分離得到一條新的cDNA Im58，根據(jù)其成熟肽的序列和大腸桿菌偏好的密碼子，設(shè)計的4條overlap引物見表1.

表1 Overlap PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for overlap PCR

Im58的基因通過2輪PCR擴(kuò)增獲得:第1輪PCR用引物Im58-FP2和Im58-RP2進(jìn)行overlap PCR擴(kuò)增.然后將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板，以引物Im58-FP1和Im58-RP1進(jìn)行第2輪PCR.兩次PCR反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，55℃ 復(fù)性 30 s，72℃ 延伸 45 s，72℃ 延伸 5 min，循環(huán)25次.PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化.

1.3 PGEX-4T-1-Im58重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體PGEX-4T-1用BamHI和XhoI雙酶切，37℃酶切12 h后，酶切產(chǎn)物分別電泳，并對雙酶切的Im58片段和載體片段分別用PCR產(chǎn)物回收試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化.分別取酶切的Im58片段和載體片段以1∶3的比例混合后，在T4DNA連接酶作用下22℃，1 h連接.構(gòu)建重組表達(dá)載體.

1.4 陽性重組克隆的篩選

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃溫箱培養(yǎng)過夜后，從含Amp的LB平板上挑取3個單克隆，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)5 h，再用PCR擴(kuò)增對培養(yǎng)物檢測.PCR的引物，反應(yīng)條件和過程同1.2，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.提取陽性克隆的質(zhì)粒，用BamHI和XhoI酶切重組質(zhì)粒，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，對篩選的陽性克隆測序.

1.5 融合蛋白誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度的選擇

將測序正確的Im58重組載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌種E.coli/Rosetta(DE3).將表達(dá)菌37℃搖過夜，次日取菌液1 mL，接種于含Amp(100 μg/mL)的100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)到OD600=0.6時，取培養(yǎng)的菌液10 mL，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo).再將菌液在28℃培養(yǎng)5 h，分別于2，3，4，5 h吸取菌液2 mL，離心、PBS重懸菌體并超聲破碎，取上清進(jìn)行Tricine系統(tǒng)的SDS-PAGE電泳.同法取培養(yǎng)的菌液5管，每管5 mL，加入IPTG的終濃度分別為 0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L 于28℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h.各收集菌液2 mL，離心、PBS重懸并超聲破碎，取上清進(jìn)行Tricine系統(tǒng)的SDS-PAGE電泳.

1.6 融合蛋白的表達(dá)純化

在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中接種表達(dá)菌，接種量為1∶100，一次表達(dá)1 L，37℃培養(yǎng)到 OD600=0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，再將菌液在28℃培養(yǎng)4 h，離心收集菌體.加入40 mL PBS重懸，超聲破細(xì)胞，離心收集上清，將收集的上清加入到GSH層析柱中.用PBS緩沖液沖洗GSH親和層析柱以去除雜蛋白，再用40 mL的GSH洗脫液洗脫融合蛋白.將收集到的融合蛋白用10KD截流的超濾管離心濃縮脫鹽至每升菌液約1 mL.超濾得到濃縮的融合蛋白用EK酶酶切，23～25℃水浴酶切過夜.

1.7 蝎毒肽Im58的RP-HPLC純化

酶切混合液離心后，取上清進(jìn)行RP-HPLC分離純化.HPLC的上樣體積是1 mL，流速為5 mL/min.RP-HPLC的固定相是C18反相柱，流動相為:溶液B是0.1%TFA，溶液D是0.1%TFA+90%的乙腈.RP-HPLC的洗脫梯度:60 min線性梯度，初始B的體積比為95%，D為5%，結(jié)束時 B的體積比為5%，D為95%;測量波長為230 nm.

1.8 純化的重組蝎毒肽的鑒定

將表達(dá)純化各個步驟的蛋白樣品取樣，進(jìn)行Tricine系統(tǒng)的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，初步鑒定多肽的分子量大小及純度.并取蛋白樣通過MALDITOF-MS精確測量多肽的分子量.

2 結(jié)果和分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

PGEX-4T-1-Im58重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建如圖1所示，PGEX-4T-1載體是帶GST標(biāo)簽含Amp抗性的克隆載體，GST標(biāo)簽在目的片段Im58前面，這種帶GST標(biāo)簽的融合蛋白組合有利于蛋白表達(dá)純化.

圖1 載體PGEX-4T-1-Im58的構(gòu)建Fig.1 Construction of vector PGEX-4T-1-Im58

2.2 Im58基因的擴(kuò)增

通過overlap PCR擴(kuò)增兩次獲得Im58全長片段，如圖2所示，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，可以見一條長度為150bp的明亮的條帶，與理論值相符合.

圖2 Im58基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 The amplification product of Im58 gene

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

如圖3所示，通過PCR鑒定和BamHI、XhoI雙酶切重組克隆質(zhì)粒鑒定法，獲得了約150 bp的目標(biāo)片段，證明重組質(zhì)粒 PGEX-4T-1-Im58已經(jīng)構(gòu)建成功.

圖3 重組質(zhì)粒PGEX-Im58的分子鑒定Fig.3 Identification of the recombined plasmid PGEX-Im58

2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

不同誘導(dǎo)條件，融合蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖4.由圖4可見，在28℃誘導(dǎo)條件下，IPTG的終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時間為2，3 h時產(chǎn)量均較低，當(dāng)誘導(dǎo)時間為4，5 h時產(chǎn)量較高.若 IPTG濃度為0.2 mmol/L時產(chǎn)量略高;故確定融合蛋白表達(dá)的最佳條件為:28℃，0.2 mmol/L IPTG，誘導(dǎo) 4 h.

圖4 不同表達(dá)條件下融合蛋白在Tricine系統(tǒng)的SDS-PAGE電泳分析Fig.4 Analysis of fusion protein by SDS-PAGE of Tricine system under different expression conditions

2.5 融合蛋白的表達(dá)純化

融合蛋白的表達(dá)純化結(jié)果見圖5.

圖5 Im58多肽在Tricine系統(tǒng)的SDS-PAGE的表達(dá)純化Fig.5 The expression and purification of Im58 peptide by SDS-PAGE of Tricine system

由圖5可見，包含重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosseta培養(yǎng)到OD600=0.6時，加入0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h后，細(xì)胞上清蛋白中多出一條約30KD的條帶，這是由于在重組表達(dá) Im58的系統(tǒng)中，在 Im58(4KD)前面融合了一個26KD的GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽所形成的GST-Im58融合蛋白.經(jīng)GST親和層析柱純化所得GST-Im58融合蛋白，經(jīng)超濾脫鹽濃縮，蛋白濃度較高.濃縮后的蛋白用EK酶酶切，產(chǎn)生一條26KD的帶(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)和一條4KD(目的蛋白Im58)的條帶.

2.6 蝎毒肽的RP-HPLC分離純化

蝎毒肽的RP-HPLC分離純化結(jié)果見圖6.如圖6所示，經(jīng)EK酶酶切后的蛋白混合物經(jīng)RP-HPLC用C18柱分離純化，60 min溶液梯度線性洗脫，230 nm紫外波長下檢測，蝎毒肽Im58得到了很好的分離.

圖6 Im58經(jīng)HPLC的分離純化Fig.6 Separation and purification of Im58 by HPLC

2.7 蝎毒肽的分子量鑒定

蝎毒肽的分子量鑒定結(jié)果見圖7.由圖7可見，將經(jīng)RP-HPLC純化的蝎毒肽進(jìn)行MALDI-TOF-MS測定分子量，測得分子量為4369.38，與預(yù)期分子量4369.4 一致.

圖7 Im58的分子量鑒定Fig.7 Identify the molecular weight of Im58

3 討論

蝎毒素是一類富含二硫鍵的小肽，其中大部分多肽可作用不同類型的離子通道，在研究離子通道的性質(zhì)和藥物開發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價值.蝎毒素由于富含二硫鍵，在重組表達(dá)毒素過程中常有諸多困難，如二硫鍵不能正確配對，表達(dá)產(chǎn)物易降解，缺乏轉(zhuǎn)錄加工修飾蛋白的機(jī)制等.本實驗采用GST融合表達(dá)系統(tǒng)成功地在大腸桿菌 E.coli/Rosetta(DE3)中表達(dá)了GST-Im58.GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛用于各種融合蛋白的表達(dá)，該系統(tǒng)與其他系統(tǒng)相比表達(dá)效率高，操作簡便，表達(dá)的蛋白質(zhì)帶有GST頭部，可利用含有還原型谷胱甘肽的純化柱進(jìn)行純化，得到單純的融合蛋白，去除背景蛋白的干擾;它還具有剪切的功能，可將GST的頭部切除，得到單一的目的蛋白，進(jìn)行相關(guān)功能的研究［13］.

為獲得和天然毒素氨基酸序列相同的蝎毒素，本研究選用單向識別切割的小腸激酶(EK酶)，它能識別DDDDK序列，并且在K之后切割蛋白，獲得的蛋白在N端不含多余的氨基酸序列，并對一些表達(dá)條件和工藝進(jìn)行了優(yōu)化，使重組蝎多肽純度高并具有良好生物活性.由于蝎多肽基因是真核生物的基因，其蛋白編碼采用的密碼子與大腸桿菌有一定的區(qū)別，采用大腸桿菌表達(dá)會在翻譯水平上對蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生不良的影響，故本研究采用經(jīng)過修飾的Rosetta菌株，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)［14］.

本研究為融合蛋白的原核表達(dá)提供一定的參考價值，同時本實驗成功表達(dá)了Im58多肽，可直接用于深入研究其生物學(xué)功能.

致謝:感謝武漢大學(xué)病毒及分子癌學(xué)實驗室李文鑫教授課題組提供的材料和陳宗運(yùn)博士方法上的指導(dǎo).

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