王迎進，張艷青，李亞雄，李艷芳，張海容

(生化分析技術(shù)研究所 忻州師范學院，山西 忻州 034000)

根皮苷(Phlorizin)是一種具有明顯生物活性的天然化合物，其化學成分是1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4，6-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-丙酮，主要從蘋果、蘋果樹皮及葉中提取而得?，F(xiàn)代藥理學研究表明根皮苷具有抗氧化、抗腫瘤及防治糖尿病、美白等生理功效［1－3］。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中最豐富的功能蛋白，也是人體內(nèi)重要的小分子藥物結(jié)合蛋白，具有運輸轉(zhuǎn)運脂肪酸、氨基酸以及多種藥物功能［4］。深入研究HSA與藥物小分子的結(jié)合作用，不僅可以從分子水平上闡述藥物小分子的藥效作用機理，而且對藥物的體外篩選、合理開發(fā)利用以及設(shè)計更加有效的藥物分子具有重要的理論指導意義。因此，HSA與藥物小分子的相互作用研究已成為生命科學、醫(yī)學和環(huán)境科學等領(lǐng)域的重要研究課題。目前有關(guān)根皮苷與HSA的相互作用研究尚未見文獻報道。本實驗采用熒光光譜和紫外光譜法研究了根皮苷與HSA的相互作用機理，得到了根皮苷與HSA相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及結(jié)合距離，根據(jù)熱力學參數(shù)確定了其相互作用力類型，采用同步熒光光譜法研究了根皮苷對HSA構(gòu)象的影響，并考察了5種金屬離子對根皮苷與HSA結(jié)合作用的影響，為闡明根皮苷在體內(nèi)的輸送和代謝過程、了解其生物學作用機理提供了實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301型熒光分光光度計、UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司);501A型超級數(shù)顯恒溫水浴(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)。

人血清白蛋白(99%，Sigma公司):稱取HSA配制成1.5×10－5mol·L－1標準液，置于冰箱中4℃保存。根皮苷(95%，北京索萊寶科技有限公司):準確稱取根皮苷配制成5.0×10－5mol·L－1標準溶液;Tris－HCl緩沖溶液(pH 7.4);實驗用水為二次蒸餾水，其它試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

準確移取一定體積的根皮苷標準溶液于10 mL比色管中，加入3.5 mL HSA標準溶液，以Tris－HCl緩沖溶液定容至5 mL，恒溫水浴30 min。以285 nm為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，恒溫掃描一定波長范圍內(nèi)HSA的熒光光譜、HSA在根皮苷作用下的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜(Δλ=15、60 nm)及紫外吸收光譜。

圖1 根皮苷對HSA的熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of phlorizin－HSA system 303 K;cHSA=1.05×10－6mol·L－1;cphlorizin(1－10):0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0(×10－6mol·L－1)

2 結(jié)果與討論

2.1 根皮苷對HSA的熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基而能發(fā)射較強的內(nèi)源熒光。在選定條件下，考察了不同濃度根皮苷溶液對BSA熒光強度的影響，結(jié)果如圖1所示。HSA在330 nm處有較強的熒光，隨著根皮苷濃度的增加，HSA在330 nm附近的熒光強度被有規(guī)律地猝滅，說明根皮苷與HSA發(fā)生了相互作用，導致HSA發(fā)生熒光猝滅。

2.2 熒光猝滅機理及猝滅常數(shù)的測定

引起HSA熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光分子之間因彼此擴散和碰撞導致熒光物質(zhì)熒光減弱的現(xiàn)象，其猝滅過程遵循Stern－Volmer方程［5］。

圖2 不同溫度下根皮苷－HSA體系的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer curves of phlorizin－HSA system at temperatures of 293，303，313 K

式中:F0和F分別為未加入和加入根皮苷時HSA的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程的猝滅速率常數(shù)(L·mol－1·s－1);τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命;Ksv為Stern－Volmer猝滅常數(shù)(L·mol－1)。生物大分子的熒光壽命約為 10－8s［6］，故可根據(jù)猝滅常數(shù)Ksv求得猝滅速率常數(shù)Kq。

靜態(tài)猝滅是由于猝滅劑與熒光物質(zhì)相互作用而生成了一定構(gòu)型化合物，導致熒光物質(zhì)熒光強度減弱的現(xiàn)象。靜態(tài)猝滅過程符合Lineweaver－Bruk雙倒數(shù)方程［7］:

式中:KLB為猝滅劑與熒光物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，也稱作Lineweaver－Bruk猝滅常數(shù)。隨溫度的升高動態(tài)猝滅常數(shù)增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)隨之減小，由此可判斷熒光猝滅類型。

按實驗方法分別測定293、303、313 K時體系的熒光猝滅光譜，據(jù)式(1)作HSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線(圖2)，據(jù)式(2)作雙倒數(shù)曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，可計算得到猝滅常數(shù)Ksv及結(jié)合常數(shù)KLB(表1)。

表1 根皮苷－HSA體系的猝滅反應常數(shù)Table 1 Quenching constants of phlorizin－HSA system

由圖2和表1可知，隨著溫度升高，根皮苷與HSA作用的猝滅曲線斜率降低;根皮苷對HSA熒光猝滅過程的Kq值遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大 Kq值(2 ×1010L·mol－1·s－1);結(jié)合常數(shù) KLB隨溫度的升高而減小;均證明根皮苷對HSA的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅，而是因根皮苷與HSA之間形成了配合物而引起的靜態(tài)猝滅［8］。

圖3 根皮苷對HSA的紫外吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of phlorizin－HSA system cHSA=1.05×10－6mol·L－1;cphlorizin(1－10)=0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0(×10－6 mol·L－1)，293 K

2.3 根皮苷與HSA的紫外吸收光譜

紫外吸收光譜是檢測是否生成復合物的一種簡單有效方法，根皮苷與HSA相互作用的紫外吸收光譜如圖3所示，由圖3可知，HSA在278 nm處有一強吸收峰，當加入根皮苷后，吸收強度隨根皮苷濃度的增加逐漸增強，且HSA的最大吸收峰發(fā)生明顯紫移(從278 nm減小到266 nm)。進一步證明了根皮苷與HSA形成了基態(tài)復合物［9］。

2.4 根皮苷與HSA的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，熒光強度與猝滅劑的關(guān)系可由結(jié)合常數(shù)表達式［10］推導求出。

將lg［(F0－F)/F］對 lg［Q］作圖，根據(jù)截距和斜率可求得相應Kb和n。結(jié)果如圖4及表2所示。由表2可知，根皮苷與HSA的結(jié)合位點數(shù)n接近1，說明根皮苷與HSA可形成1個結(jié)合位點。結(jié)合常數(shù)Kb值較大(在105數(shù)量級)，且隨著溫度的升高而降低，表明根皮苷與HSA之間有較強的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運輸和儲存。

2.5 根皮苷與HSA結(jié)合反應的熱力學性質(zhì)及作用力

分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用。當溫度變化不大時，反應的焓變ΔH、熵變ΔS可認為是常數(shù)，由熱力學公式可計算根皮苷與HSA相互作用的熱力學函數(shù)值。由表3可知，根皮苷與HSA的相互作用過程是一個放熱熵減少過程。根據(jù)Ross等［11］總結(jié)的生物大分子與小分子作用力類型的熱力學規(guī)律，結(jié)合過程ΔrHm＜0，ΔrSm＜0，可以推測根皮苷與HSA形成復合物歸因于氫鍵和范德華的形成。這與根皮苷結(jié)構(gòu)中存在多個羥基，易形成氫鍵的事實相符。而ΔrGm＜0，表明根皮苷與HSA的相互作用是自發(fā)過程。

圖4 根皮苷對HSA熒光猝滅的Lineweaver－Bruk圖Fig.4 Lineweaver－Bruk curves of HSA quenched by phlorizin

表2 根皮苷－HSA體系的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)Table 2 The binding constants and binding sites of phlorizin－HSA system

2.6 根皮苷－HSA體系的同步熒光光譜

Δλ為15、60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征［12］。固定HSA濃度逐漸增加根皮苷濃度時，記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜(圖5)。由圖可知，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本不變，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移，發(fā)射波長由339 nm紅移至343 nm。表明根皮苷的介入引起HSA構(gòu)象的變化，使色氨酸周圍微環(huán)境的親水性增強，HSA結(jié)構(gòu)變得舒展，更易被水分子接近［13］。另外，色氨酸殘基的熒光強度降低比酪氨酸殘基顯著，說明根皮苷與HSA的結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基。

表3 根皮苷與HSA結(jié)合過程的熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of phlorizin－HSA binding procedure

2.7 根皮苷與HSA作用距離計算

根據(jù)F rster偶極－偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［14］，可以求出小分子與蛋白質(zhì)分子中發(fā)射熒光基團之間的距離，距離越小，藥物分子越易于被蛋白質(zhì)儲存與運輸，越能發(fā)揮其藥理作用，能量轉(zhuǎn)移效率E與給體－受體間距離r的關(guān)系為:

能量轉(zhuǎn)移效率(E)為50%時，臨界距離R0(福斯特距離)為:

式中，K為供體和受體各項隨機分布的取向因子，n為介質(zhì)的折射指數(shù)，ΦD為給體的熒光量子產(chǎn)率，J為供體的發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。

只要得到E、K2和n并通過測定光譜求出積分J，就可計算出R0和r。

HSA的熒光光譜和根皮苷的吸收光譜如圖6所示，將光譜重疊部分分割成極小的矩形，通過式(6)求得重疊積分 J(v)=7.54 ×10－15。

上述實驗條件下，取向因子供體受體各項隨機分布的平均值K2=2/3，n折射指數(shù)取水和有機物平均值n=1.336，ΦD=0.118，將上述數(shù)值代入式(5)求得R0=2.34 nm。再用根皮苷與HSA等摩爾混合后的熒光強度，通過式(6)計算得到能量轉(zhuǎn)移效率E=0.04。經(jīng)式(4)求得根皮苷與色氨酸殘基的最短距離r=3.97 nm，說明根皮苷與HSA足夠靠近(r＜7 nm)，其結(jié)合是通過非輻射能量轉(zhuǎn)移促使蛋白質(zhì)的熒光猝滅。

圖5 根皮苷－HSA體系的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of phlorizin－HSA system

圖6 HSA的熒光光譜與根皮苷的吸收光譜Fig.6 Fluorescence spectra of HSA and the absorption spectra of phlorizin

2.8 金屬離子干擾

生物體內(nèi)含有多種微量金屬元素，這些元素共同參與各種生命活動。研究微量元素與生物體的作用機理，可以深入了解微量元素在生物體內(nèi)的生理功能。因此，研究了 Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+5種金屬離子對根皮苷－HSA結(jié)合體系的影響，結(jié)果見表 4。由表 4可知，Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+的介入對根皮苷與 HSA的結(jié)合常數(shù)影響較小。而Mg2+的介入使根皮苷與HSA的結(jié)合常數(shù)增加了1個數(shù)量級，原因可能是Mg2+在根皮苷與HSA分子之間起到“離子架橋作用”，形成了根皮苷－Mg2+－HSA 復合物［15］。

3 結(jié)論

根皮苷對HSA的熒光存在猝滅作用，其熒光猝滅過程是由于形成復合物而引起的靜態(tài)猝滅，且發(fā)生了分子內(nèi)的非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)熱力學參數(shù)與作用力關(guān)系確定二者之間主要以氫鍵及范德華力相互作用;同步熒光光譜表明根皮苷主要與HSA的色氨酸殘基相互作用，并能改變其局部構(gòu)象;而金屬離子的存在會影響根皮苷與HSA間的結(jié)合能力。

表4 金屬離子對根皮苷－HSA體系結(jié)合常數(shù)的影響(293 K)Table 4 Effects of metal ions on binding constant of phlorizin－HSA system(293 K)

［1］Lotito S B，F(xiàn)rei B.Free Radical Biol.Med.，2004，36(2):201 －211.

［2］Dong H Q，Ning Z X.Food Sci.Technol.(董華強，寧正祥.食品科技)，2006，31(12):192－195.

［3］Xie Y，Lai W，Wan M J，Xie X Y，Chen L.Chin.J.Aesthetic Med.(謝陽，賴維，萬苗堅，謝小元，陳力.中國美容醫(yī)學)，2008，17(7):1032－1034.

［4］Liu J Q，Tian N，Tian X，Hu Z D，Chen X G.Bioorg.Med.Chem.，2004，12:469－474.

［5］Yang P，Gao F.Principles of Bioinorgainic Chemisty.Beijing:Science Press(楊頻，高飛.生物無機化學原理.北京:科學出版社)，2002.

［6］Lakowica J R，Weber G.Biochemistry，1973，12(21):4161 －4170.

［7］Jiang A G.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(姜吉剛.理化檢驗－化學分冊)，2010，46(11):1286－1288.

［8］Li Y Q，Jia B X，Yao X Q，Ji H W，Guo F G，Qi Y X.J.Instrum.Anal.(李玉琴，賈寶秀，姚曉軍，冀海偉，郭豐廣，齊永秀.分析測試學報)，2009，28(12):1396－1400.

［9］Ge F，Chen C Y，Liu D Q，Han B Y，Xiong X F，Zhao S L.J.Lumin.，2010，130(1):168 －173.

［10］Wang S，Wang H，Wang R W.J.Anal.Sci.(王帥，王海，王日為.分析科學學報)，2011，27(5):627－630.

［11］Ross P D，Subramanian S.Biochemistry，1981，20(11):3096－3102.

［12］Liu C H，Li Y Q，Jia B X，Qi Y X，Li K.J.Instrum.Anal.(劉彩紅，李玉琴，賈寶秀，齊永秀，李珂.分析測試學報)，2011，30(5):532－536.

［13］Abert W C，Gregory W M，Allan G S.Anal.Biochem.，1993，213:407.

［14］F rster T，Sinanoglu O.Modern Quantum Chemistry.NewYork:Acacemic Press，1966.

［15］Wang N，Liu Z Y，Hu X L，Bo F Q，Zhao X Z.Chem.J.Chin.Univ.(王寧，劉忠英，胡秀麗，卜鳳泉，趙學忠.高等學?；瘜W學報)，2011，32(2):241.