胡 陽，吳光斌，倪 輝

(集美大學(xué) 生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

苯二胺類染發(fā)劑是目前應(yīng)用最廣泛的染發(fā)劑原料，具有染色效果好、色調(diào)變化寬、維持時(shí)間長等諸多優(yōu)點(diǎn)［1］，也是已確認(rèn)的有害物質(zhì)，可經(jīng)皮膚吸收，引起皮疹和使肝臟受損害，吸入粉塵可引起過敏、鼻炎、支氣管炎、發(fā)燒等不同病癥，經(jīng)常染發(fā)或職業(yè)上使用含苯二胺類染發(fā)劑的人，其膀胱癌、皮膚癌和淋巴瘤患病率顯著高于常人［2－5］。p-苯二胺N位取代衍生物是染發(fā)劑中常見的染料，在化妝品中屬于嚴(yán)格禁限用物質(zhì)。Jean-Luc等［6］證實(shí)p-苯二胺及其N-乙?；蚇，N-雙乙?；〈飳θ梭w有遺傳毒性。我國《化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB7916－87)［7］和《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)［8］對其作了嚴(yán)格的限量要求，規(guī)定該4種染料成分最大不超過6.0%。

針對種類繁多的染料成分，各國科學(xué)家一直在積極研究新的檢測方法以適應(yīng)不斷增加的染發(fā)劑檢測要求，已有方法主要包括薄層色譜［9］、高效液相色譜(HPLC)［10－11］、液相色譜 －質(zhì)譜(HPLCMS)［12］、氣相色譜(GC)［13］、氣相色譜 － 質(zhì)譜(GC － MS)［14］、毛細(xì)管電泳［15］等。苯二胺類染料成分具有極性強(qiáng)、揮發(fā)性低及不穩(wěn)定的特點(diǎn)，HPLC是較理想的檢測方法。Axel等［16］使用HPLC/DAD和ECD檢測生物樣品中的p-苯二胺及其衍生物N-乙?；?p-苯二胺和N，N-雙乙?；?p-苯二胺，于文蓮等［17］采用液相色譜法對染發(fā)劑中5種N-氨基N-硝基苯酚的同分異構(gòu)體進(jìn)行同時(shí)測定，但目前國內(nèi)外針對染發(fā)劑中多種p-苯二胺N位衍生物的分析研究較少。本文建立了染發(fā)劑中N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽(DHPD)、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽(DMPD)、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽(DEPD)、N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽(PPD)4種p-苯二胺N位衍生物的高效液相色譜檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525高效液相色譜儀，配紫外檢測器(美國Waters);PH211型pH計(jì)(意大利Hanna);KQ-250E型超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司);EL104型電子天平(瑞士Mettler-Toledo，感量0.1 mg);5415D型離心機(jī)(德國Eppendorf);0.45 μm有機(jī)濾膜。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥98%):N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽均購自日本東京化成公司。

乙腈(美國天地公司)、辛烷磺酸鈉(美國Sigma公司)均為色譜純;亞硫酸鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乙醇均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 溶液配制 25 mmol/L磷酸鹽緩沖液體系:稱取十二水合磷酸氫二鈉0.958 g、磷酸二氫鉀3.06 g、辛烷磺酸鈉1.0 g溶于約900 mL超純水中，磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，最后定容至1 000 mL，經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾;1%亞硫酸鈉溶液:稱取1.0 g亞硫酸鈉溶于約90 mL超純水中，定容至100 mL;單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取62.5 mg N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽4種標(biāo)準(zhǔn)品，各加入25 mg亞硫酸鈉，用乙醇水溶液(50%)定容至25 mL容量瓶中，混勻。該溶液的濃度為2.5 g/L，－18℃保存一周;混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別移取適量的各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙醇－水溶液稀釋成濃度為0.5、1、5、50、100、200、400 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品處理 準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品(精確至0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加入約10 mL 50%乙醇水溶液，使樣品完全溶解，然后加入1 mL 1%的亞硫酸鈉，用50%乙醇水溶液定容。渦旋混合后超聲提取15 min，轉(zhuǎn)移至離心管以4 000 r/min離心5 min，取上清液并過0.45 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行高效液相色譜檢測。

1.3 液相色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司);流動(dòng)相:A相為25 mmol/L磷酸緩沖液體系(pH 6.0，含0.1%的辛烷磺酸鈉)，B相為乙腈;梯度洗脫:0～5 min，5%～30%B，5～9 min，30%～40%B，9～13 min，40%～90%B，13～15 min，90%～5%B，15～25 min，5%B。流速:1.0 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:250、280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

本方法采用50%乙醇水溶液超聲波提取，由于染料中間體極易氧化變質(zhì)，因此在提取過程中加入1 mL 1%的亞硫酸鈉溶液作為還原劑以提高染料的回收率。樣品無需凈化，即采用提取液離心去沉淀并過濾后直接進(jìn)樣，方法簡便、快速。

2.2 液相色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 采用紫外分光光度計(jì)對4種目標(biāo)物進(jìn)行紫外區(qū)波長掃描，得到其紫外吸收光譜圖(見圖1)。由各物質(zhì)的紫外吸收光譜可知，N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽在250 nm有特征吸收，N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽在280 nm有特征吸收，因此實(shí)驗(yàn)選用250 nm和280 nm作為定量檢測波長。

圖1 4種p-苯二胺N位取代衍生物標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectra of four N-substituted derivatives standards

2.2.2 色譜柱的選擇 相關(guān)研究表明使用C8柱分離染發(fā)劑中的染料成分效果不佳［10］，因此實(shí)驗(yàn)選用普通C18與普通C16柱進(jìn)行分離效果的比較，結(jié)果顯示待測組分在兩種色譜柱上的保留無明顯差異，考慮到色譜柱的適用性，選擇普通C18柱對待測物進(jìn)行分離。

2.2.3 流動(dòng)相體系的選擇 考慮到樣品中的其它苯二胺類物質(zhì)對待測4種染料成分分離的影響，根據(jù)實(shí)際樣品基質(zhì)的干擾情況對流動(dòng)相比例及梯度進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)研究了不同溶劑、pH值及離子對試劑對分離效果的影響?？疾炝怂状?、水－乙腈、磷酸鹽緩沖液體系－甲醇(用NaOH調(diào)至pH 6.0、6.5、7.0)、磷酸鹽緩沖液體系－乙腈(用NaOH調(diào)至pH 6.0、6.5、7.0)、磷酸鹽緩沖液體系－乙腈(用NaOH調(diào)至pH 6.0、6.5、7.0，含0.1%的辛烷磺酸鈉)5種流動(dòng)相體系對實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果表明采用乙腈作為有機(jī)相較甲醇能獲得更好的峰形及保留;采用pH 6.0的流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)物的分離效果最優(yōu);采用添加辛烷磺酸鈉的離子對試劑可以改善峰形，使4種目標(biāo)物在20 min內(nèi)得到良好分離，且重現(xiàn)性較好。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇磷酸鹽緩沖液體系－乙腈(用NaOH調(diào)至pH 6.0，含0.1%的辛烷磺酸鈉)作為最佳流動(dòng)相。

由于等度洗脫難以將4種目標(biāo)物與樣品中的其它染料成分有效分離。因此采用梯度洗脫，當(dāng)磷酸鹽緩沖液體系－乙腈的體積比為95∶5時(shí)，可將N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽與樣品中其它復(fù)雜的染料成分完全分離;緩慢增加乙腈的比例，可使較難分離的N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽和N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽得到有效分離;N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽的出峰時(shí)間較晚，可通過提高乙腈比例使其快速出峰。優(yōu)化的流動(dòng)相梯度洗脫條件如“1.3”所述。

2.2.4 柱溫的選擇 考慮到溫度對氧化型染料成分有一定的影響，因此選擇25℃作為檢測溫度，既可保證保留時(shí)間的穩(wěn)定性，又可排除溫度對4種目標(biāo)物的影響。

在上述優(yōu)化的液相色譜條件下對標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品進(jìn)行測定，4種染料成分標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的液相色譜圖見圖2。由圖可見，4種目標(biāo)物在20 min內(nèi)得到良好分離，且峰形對稱，能達(dá)到基線分離。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對不同質(zhì)量濃度的4種染料標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，4種染料的質(zhì)量濃度在0.1～400 mg/L范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r為0.999 2～0.999 9。分別以S/N=3和S/N=10計(jì)算方法的檢出限與定量下限(見表1)。結(jié)果顯示，方法的檢出限為18～108 mg·kg－1，定量下限為42～320 mg·kg－1，完全滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對染發(fā)劑的檢測要求。

圖2 4種p-苯二胺N位取代衍生物標(biāo)準(zhǔn)品(A)及染發(fā)劑樣品(B)的色譜圖Fig.2 HPLC of four dye standards(A)and four dye samples(B)peak identifications:1.DHPD;2.DMPD;3.DEPD;4.PPD

表1 4種p-苯二胺N位取代衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限及定量下限Table 1 Regression equations，correlation coefficients，limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)for four dye standards

2.4 回收率與精密度

選擇染發(fā)劑5號(hào)樣品(4種p-苯二胺N位取代衍生物均未檢出)，在所確定的定量下限基礎(chǔ)上添加3個(gè)不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行多水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6次，計(jì)算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表2)。結(jié)果表明，4種染料成分的加標(biāo)回收率為83%～115%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，說明該檢測方法的準(zhǔn)確度好、精密度高。

表2 4種p-苯二胺N位取代衍生物在染發(fā)劑樣品中的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and RSDs of four dye standards(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的測定

利用本方法測定了6種市售染發(fā)劑中4種N位取代衍生物的含量(以鹽的形式計(jì))，結(jié)果見表3。所測的6種樣品中，均未檢出N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽和N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽，只有6號(hào)樣品棕黑色染發(fā)劑檢出N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽;此外，除5號(hào)樣品外，其余樣品均檢出了N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽。

表3 市售部分染發(fā)劑中p-苯二胺N位取代衍生物含量普查結(jié)果Table 3 Detection results of some hair dyes saled in market w/(mg·kg－1)

3 結(jié)論

本文針對4種染發(fā)劑中的p-苯二胺N位衍生物建立了高效液相色譜檢測方法，該方法精密度好、回收率高、簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于染發(fā)劑中N，N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸鹽、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、N-苯基-p-苯二胺鹽酸鹽的測定。

［1］Brown K C，Soc J.Cosmet.Chem.，1982，33:375.

［2］Thun M J，Altekruse S F，Namboodiri M M，Calle E E.Natl.Cancer Inst.，1994，86:210 －215.

［3］Gago D M，Castelao J E，Yuan J M，Yu M C，Ross R K.Int.J.Cancer，2001，91:575－579.

［4］Andrew A S，Schned A R，Heaney J A，Karagas M R.Int.J.Cancer，2004，109:581 －586.

［5］Zhou Y G，Li Z G.J.Lab.Med.(周永貴，李真觀.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué))，2008，25(1):100－104，107.

［6］Jean－Luc G，Mark B，Tirukalikundram K，Mel L，Gerhard J N，David K，Herve T.Mutat.Res.，2006，608:58－71.

［7］Ministry of Healthy of the People s Republic of China.Hygienic Standards for Cosmetics.GB 7916 － 1987.Beijing:China Standards Publishing House(中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 7916－1987化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社)，1987.

［8］Ministry of Healthy of the People s Republic of China.Hygienic Standards for Cosmetics，2007 ed.Beijing:Military Medical Science Press(中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范，2007版.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社)，2007.

［9］Tamas K，Albert W G.Anal.Biochem.，2004，327:97－106.

［10］Zhu H J，Yang Y W，Zhang W Q，Zhu Y.Chin.J.Chromatogr.(朱會(huì)卷，楊艷偉，張衛(wèi)強(qiáng)，朱英.色譜)，2008，26(5):554－558.

［11］Motoko N，Kazuo M，Kauffmann J.Anal.Chim.Acta，2007，588:316－320.

［12］Yu W L，Du Z X，Wang L F，Cheng Y，Sun X，Wang Z，Li L，Zhang J.Chin.J.Anal.Chem.(于文蓮，杜振霞，王立峰，程艷，孫鑫，王崢，李蕾，張靜.分析化學(xué))，2009，37(10):129.

［13］Xue J H，Liang C，Li C.Appl.Chem.Ind.(薛金花，梁超，李程.應(yīng)用化工)，2011，40(2):349－352.

［14］Lai Y，Chen H X，Lin R，Wang H H，Dong Q M，Huang Z P.Chem.Res.Chin.Univ.(賴鶯，陳和秀，林睿，王鴻輝，董清木，黃宗平.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào))，2011，32(10):2286－2292.

［15］Lu Y C，Wang H Y，Song P P，Liu S H.Chin.J.Chromatogr.(盧玉超，王海燕，宋萍萍，劉書慧.色譜)，2011，29(11):1122－1127.

［16］Axel M，Brunhilde B，Klaus F.J.Chromatogr.B，2009，877:1627－1633.

［17］Yu W L，Chen W，Zhou X，Wang L F，Sun X，Wang Z，Chen H M.J.Instrum.Anal.(于文蓮，陳偉，周新，王立峰，孫鑫，王崢，陳會(huì)明.分析測試學(xué)報(bào))，2009，28(8):975－977.