郭 純 王宇紅， 蔡光先，△ 李東雅 藺曉源 易 健

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208）

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙性疾病，具有高患病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高致死率等特點。腦源性神經(jīng)因子（BDNF）屬于神經(jīng)營養(yǎng)素家族，對發(fā)育過程中神經(jīng)元的存活、分化以及成年神經(jīng)元的存活和功能起重要作用。研究表明，BDNF及其受體酪氨酸激酶B（TrkB）在抗抑郁治療中發(fā)揮重要作用［1］。本研究采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激復(fù)制抑郁模型大鼠，觀察海馬BDNF和TrkB的表達(dá)及中藥復(fù)方百事樂膠囊的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠32只，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。

1.2 試藥與儀器 百事樂膠囊，由湖南省中醫(yī)藥研究院制備，規(guī)格0.38 g/粒，成人日用量9粒，相當(dāng)于生藥15 g/d，批號20110322。鹽酸氟西汀，禮來蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20 mg/粒，成人用量為20 mg/d，批號J20080016。BDNF、TrkB多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PV9000試劑盒、DAB顯色劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。YLS-9A生理藥理電刺激儀 （山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；Finesse 325型石蠟切片機 （英國Shando公司）；Bx51光學(xué)顯微鏡及IPP6.0圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.3 模型制備 32只SD大鼠區(qū)分雌雄適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按雌雄各半隨機選取8只作為正常組，正常飲水?dāng)z食，不給予任何刺激。其他大鼠單籠孤養(yǎng)，并接受各種應(yīng)激刺激，刺激方法參照Kart法改進，包括：12 h禁食，12h禁水，光照過夜，6℃冷水游泳5 min，45℃熱水游泳5 min，夾尾 5 min，潮濕飼養(yǎng)，超聲刺激 1 h（50 kHz），電擊足底（電壓50 V，每隔1 min刺激1次，每次持續(xù)30 s，共5次）。每日隨機給予1種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)，持續(xù)21 d。

1.4 分組與給藥 大鼠給予21 d刺激后，根據(jù)同階層行為學(xué)指標(biāo)按隨機數(shù)字表法將實驗動物分為模型組、氟西汀組、百事樂組，每組雌雄各半。每日灌胃給藥1 h后，再隨機給予1種刺激，持續(xù)21d。模型組大鼠灌胃蒸餾水，氟西汀組大鼠灌胃鹽酸氟西汀藥液1.8mg/（kg·d），百事樂組灌胃百事樂膠囊藥液，根據(jù)體表面積將成人日用量換算成大鼠日用量，按生藥量為1.33 g/（kg·d），灌胃量為1 mL/100 g體質(zhì)量。

1.5 行為學(xué)測定 于造模前1 d，造模第21日，給藥第21日在安靜房間內(nèi)采用Open-field法進行行為學(xué)測定。實驗用黑色敞箱為方形（80 cm×80 cm×40 cm），底面用白線劃分為面積相等的25個格子。實驗時將動物放在正中，以動物三爪以上跨入鄰格計為水平活動1分，兩前肢離地或攀附墻壁1 cm以上計為垂直活動1分。每只大鼠適應(yīng)1 min后，記錄3 min內(nèi)的水平和垂直得分。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測與分析 于給藥第22日用10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔注射麻醉動物，斷頭取腦，于4%多聚甲醛中固定24 h。將腦組織酒精梯度脫水，二甲苯透明，然后石蠟浸透、包埋。包埋材料修塊后行冠狀切片，片厚5 μm。切片放入3%過氧化氫孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗3 min，3次；轉(zhuǎn)移至裝滿PBS的微波修復(fù)缸中，加熱至沸騰30 s，進行抗原修復(fù)，0.01 mol/L PBS洗 3 min，3次；各組動物腦組織切片分別滴加入稀釋的兔抗大鼠BDNF多克隆抗體（1∶100）和兔抗大鼠TrkB多克隆抗體 （1∶100）50 μL， 陰性對照用 0.01 mol/L PBS 替代一抗，37℃冰箱孵育 2 h，0.01 mol/L PBS洗 3 min，3次；滴加PV-9000試劑盒的生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育 30 min，0.01 mol/L PBS洗 3 min，3次； 滴加PV-9000試劑盒辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素，37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗3 min，3次； 滴加DAB顯色劑室溫顯色10 min，蒸餾水洗終止反應(yīng)；將切片放入蘇木素染液中染色10 min，流水沖洗5 min，0.5%鹽酸酒精分化液中分色10 s，流水沖洗2 min，鏡檢著色較好后，蒸餾水清洗切片；梯度酒精和二甲苯脫水透明切片，中性樹脂封片。對于BDNF每一指標(biāo)每個腦組織取3張切片，每張切片于400倍物鏡下隨機選取海馬區(qū)域5個視野，用Image Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)進行陽性表達(dá)面積計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)的影響見表1。曠場實驗測定各組大鼠的水平和垂直活動次數(shù)，與正常組相比，造模后各組動物的水平和垂直活動次數(shù)均下降（P<0.05或0.01）。給藥后，百事樂組動物活動水平顯著增加，水平活動次數(shù)和垂直活動次數(shù)與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或0.01）。

表1 大鼠曠場試驗水平和垂直運動次數(shù)（）

表1 大鼠曠場試驗水平和垂直運動次數(shù)（）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬BDNF和TrkB表達(dá)的影響 應(yīng)用免疫組化方法檢測BDNF和TrkB在大鼠海馬中的表達(dá)，以胞漿或突起染成棕黃色為陽性表達(dá)。由圖1、圖2和表2可知，大鼠海馬中BDNF的陽性表達(dá)高于TrkB的陽性表達(dá)；與正常組相比，模型組大鼠海馬BDNF和TrkB陽性表達(dá)面積明顯減少 （P<0.01）；與模型組相比，百事樂組大鼠海馬BDNF和TrkB的陽性表達(dá)面積明顯增多（P<0.01），其數(shù)值與正常組和氟西汀組接近。

3 討 論

圖1 免疫組化顯示海馬BDNF的表達(dá)（400倍）

圖2 免疫組化顯示海馬TrkB的表達(dá)（400倍）

表2 大鼠海馬BDNF和TrkB陽性表達(dá)面積（）

表2 大鼠海馬BDNF和TrkB陽性表達(dá)面積（）

抑郁癥屬中醫(yī)“郁證”范疇，病始在肝，及于心神。中藥復(fù)方以多成分、多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的藥理學(xué)作用見長，擅長身心整體調(diào)理，在抑郁癥的治療中具有一定優(yōu)勢，因此，探索抗抑郁中藥的作用機制備受關(guān)注。百事樂膠囊由姜黃、人參和貫葉連翹組成，具有疏肝解郁、寧心安神的功效，其臨床療效確切，是治療抑郁癥的有效專藥［2］。前期對其抗抑郁作用機制進行了一些有益的探索，研究表明百事樂膠囊能顯著改善慢性應(yīng)激抑郁小鼠的行為學(xué)變化，下調(diào)慢性應(yīng)激所致小鼠血清白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α水平［3］，上調(diào)慢性應(yīng)激抑郁小鼠腦內(nèi)BDNF、NGF的表達(dá)［4］。

BDNF是神經(jīng)因子家族的重要成員，其作用比較廣泛。BDNF在胚胎發(fā)育期對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化、成熟以及突觸的形成不可缺少，在成年期對神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性具有重要作用［5-6］。臨床和基礎(chǔ)研究的結(jié)果表明，抑郁癥會降低BDNF的表達(dá)和神經(jīng)發(fā)生。而抗抑郁治療可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，并形成了抑郁癥的神經(jīng)營養(yǎng)因子假說［1］。BDNF在抑郁癥的治療中可能主要通過3方面發(fā)揮作用［7］：第一，增加突觸可塑性，進而影響長時程增強（LTP），而LTP是學(xué)習(xí)和記憶形成的基礎(chǔ)；其次，促進神經(jīng)發(fā)生，尤其是海馬的神經(jīng)發(fā)生，提高海馬神經(jīng)元的存活；第三，促進細(xì)胞生存，對各種神經(jīng)元的發(fā)育分化與生長再生具有維持和促進作用。

BDNF是基因與環(huán)境、突觸可塑性和細(xì)胞凋亡相互關(guān)聯(lián)不可缺少的信息傳遞環(huán)節(jié)，在精神異常疾病中發(fā)揮重要作用［8］。BDNF通過與特異性受體TrkB結(jié)合，使TrkB自身磷酸化，進而激活鈣調(diào)蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶途徑、磷酸肌醇3-激酶途徑等信號通路，最后激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，引起B(yǎng)DNF和抗調(diào)亡蛋白Bcl-2等表達(dá)增加，以增加突觸可塑性、促進細(xì)胞生存和神經(jīng)發(fā)生。TrkB信號通路與腦的營養(yǎng)效應(yīng)相關(guān)聯(lián)，而很多精神治療藥物也普遍性地以提高BDNF 的表達(dá)水平為目標(biāo)［9］。

本研究結(jié)果顯示，相比于正常組，模型組大鼠行為學(xué)活動水平明顯降低，海馬BDNF和TrkB的表達(dá)顯著下降；百事樂膠囊能改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠的行為學(xué)活動水平，提高大鼠海馬BDNF和的表達(dá)，與正常組和氟西汀組接近。因此，提高海馬BDNF及其受體TrkB的表達(dá)，是百事樂膠囊促進海馬神經(jīng)功能恢復(fù)的作用機制之一，但其深入的機制還有待進一步研究。

［1］Megan E，Kozisek，David M，et al.Brain-derived neurotrophic factor and its receptor tropomyosin-related kinase B in the mechanism of action of antidepressant therapies［J］.Pharmacology&Therapeutics，2008，117（1）：30-51.

［2］李東雅.百事樂膠囊治療肝氣郁結(jié)型抑郁癥的臨床研究［D］.長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

［3］郭純，蔡光先，劉柏炎，等.百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁小鼠血清IL-1β和TNF-α的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，32（11）：24-26.

［4］郭純，藺曉源，杜可，等.百事樂膠囊對慢性應(yīng)激抑郁小鼠神經(jīng)因子表達(dá)的影響［J］.湖南中醫(yī)雜志，2013，29（1）：121-123.

［5］Kata LC，Lo DC.Neurotrophins and synaptic plasticity ［J］.Annu Rev Neurosci，1999，22（2）：295-318.

［6］Alejandro FS，Mu-ming P.The neurotrophin hypothesis for synaptic plasticity［J］.TrendsinNeurosciences，2000，23（12）：639-645.

［7］周小江，胡園，劉屏.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與抑郁癥的研究進展［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2011，38（12）：1085-1090.

［8］Sivasankaran B，Aleksandar J.Brain derived neurotrophic factor：a novel neurotrophin involved in psychiatric and neurological disorders［J］.Pharmacology&Therapeutics，2012，134（1）：116-124.

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