李美荃，張春勇，滿 意，安清聰，陳克嶙，郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

在現(xiàn)代仔豬生產(chǎn)中，由于大量使用抗生素導(dǎo)致藥物殘留和耐藥性的問(wèn)題備受社會(huì)關(guān)注，研究和使用抗生素替代品是改善仔豬健康和生產(chǎn)性能的有效途徑之一博落回提取物。(MCE)主要成分-生物堿有很強(qiáng)的生物活性，具有抗菌、抗腫瘤、改善肝功能、抗瘧、殺蟲(chóng)等功效。Pavel Kosina[1]研究表明，含有MCE、血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿等對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌均具有一定的抑制作用。萬(wàn)學(xué)攀[2]用博落回生物堿分離得到的部分物質(zhì)進(jìn)行了抑菌活性的檢測(cè)，以血根堿和白屈菜紅堿為主要成分的混合物抑菌效果最好，除沙門(mén)氏菌外，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、無(wú)乳鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、蠟樣芽孢桿菌有很好的抑制效果。MCE中的血根堿有很強(qiáng)的廣譜抑菌作用。何夏陽(yáng)[3]在斷奶仔豬飼糧中添加0.5 mg/kg血根堿顯著提高了斷奶仔豬平均日增重、降低了料重比和腹瀉率。由于抗生素藥物殘留和耐藥性問(wèn)題而不能大量使用的情況下，植物提取物作為飼料添加劑使用是目前研究熱點(diǎn)，而MCE作為仔豬抗生素替代品具有研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。本試驗(yàn)旨在研究MCE對(duì)病原微生物的抑菌效力、細(xì)胞應(yīng)激參數(shù)、斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血液免疫和抗氧化參數(shù)的影響，為MCE在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用健康PIC五元仔豬60頭，35日齡斷奶，隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭。A組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，B、C和D組分別飼喂添加2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg MCE的試驗(yàn)日糧，E組飼喂添加50 mg/kg土霉素的試驗(yàn)日糧。試驗(yàn)期為35～60日齡。

本研究萃取的MCE經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，生物總堿含量為64%，其中血根堿含量為45%，白屈菜紅堿含量為19%。

選用大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行MCE抑菌效力試驗(yàn)。

選用豬皮膚成纖維細(xì)胞(由本實(shí)驗(yàn)室提供)，參照駱雪[4]方法，采用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞建立應(yīng)激模型。

1.2 基礎(chǔ)日糧配制

以可消化氨基酸為基礎(chǔ)，參照NRC(1998)豬營(yíng)養(yǎng)需要和PIC五元雜交豬種營(yíng)養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)日糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬自由采食和飲水，按種豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)和免疫規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)管理。記錄采食量。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，分別空腹稱(chēng)重和計(jì)算60日齡日增重、日采食量和料重比。60日年齡時(shí)，前腔靜脈采血5 mL，制備血清備用。細(xì)胞培養(yǎng)液IgG、LSZ和血清IgG、LSZ、SOD、MDA、GSH-Px采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。參照駱雪等(2012)方法，測(cè)定MCE抑菌效力和MCE最小抑菌濃度。

表1 基礎(chǔ)日糧與營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Basal diet and nutrient levels (air-dry basis)

注：①預(yù)混料為每千克飼料提供：鐵 120 mg；銅 200 mg；錳 80 mg；鋅 100 mg；碘 0.3 mg；維生素A 12 000 IU；維生素D 3 000 IU；維生素E 28 IU；維生素K35 mg；維生素B13 mg；維生素B28 mg；維生素B62 mg；維生素B120.04 mg；泛酸 22 mg；膽堿 0.024 g；尼克酸 40 mg；生物素 0.2 mg；葉酸 1 mg。 ②消化能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。

Note:①The premix provided the following per kg of diet: Fe 120 mg;Cu 200 mg;Mn 80 mg;Zn 100 mg;I 0.3 mg;VA 12 000 IU;VD 3 000 IU;VE 28 IU;VK35 mg;VB13 mg;VB28 mg;VB62 mg;VB120.04 mg;pantothenic acid 22 mg;choline chloride 0.024 g;nicotinic acid 40 mg;biotin 0.2 mg;folic acid 1 mg;②DE was a calculated value，while the others were measured values.

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2軟件處理和分析，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。所有試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCE的抑菌效力與最小抑菌濃度

2.1.1 MCE的抑菌效力 由表2可知，隨MCE溶液濃度增大，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果增強(qiáng),抑菌圈直徑也逐漸增大見(jiàn)圖1，MCE對(duì)4種細(xì)菌的抑制效果分別是：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門(mén)氏菌。

2.1.2 MCE的最小抑菌濃度 將MCE溶液按2 560 μg/mL、1 280 μg/mL、640 μg/mL、320 μg/mL、160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL的濃度梯度測(cè)定最小抑菌濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。觀察發(fā)現(xiàn)，MCE稀釋度越大，肉湯越渾濁，說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)越多。MCE對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1 280 μg/mL、1 280 μg/mL、2 560 μg/mL、2 560 μg/mL。

表2 不同濃度博落回提取物對(duì)腸道微生物抑制效果(抑菌圈直徑，mm)Table 2 Different concentrations of Macleaya cordata extract inhibited the intestinal microbiota (diameter of inhibited halo, mm)

圖1 不同濃度博落回提取物對(duì)腸道微生物抑制效果(抑菌圈直徑，mm)Fig.1 Different concentrations of Macleaya cordata extract inhibited the intestinal microbiota (diameter of inhibited halo, mm)

注：A:大腸桿菌；B：沙門(mén)氏菌；C：金黃色葡萄球菌；D枯草芽孢桿菌

Note:A:Escherichiacoli;B:Salmonella;C:Staphylococcusaureus;D:Bacillussubtilis

表3 MCE的最小抑菌濃度Table 3 Macleaya cordata extract minimum inhibitory concentration determination

注：“-”表示沒(méi)有長(zhǎng)菌，“+”表示少量長(zhǎng)菌，“++”表示適度長(zhǎng)菌，“+++”表示大量長(zhǎng)菌。

Note:“-”means no bacteria,“+”means a small amount of bacteria,“++”means bacteria modest,“+++”means a large number of long-bacteria.

2.2 MCE對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

由表4可知，35～60 d，C組日采食量比對(duì)照組提高了6.7%(P<0.05)，B組與C組日采食量差異不顯著(P>0.05)；C組日增重比對(duì)照組提高了9.0%(P<0.05)，B組與C組日增重差異不顯著(P>0.05)；B、C組料重比顯著低于A、D、E組(P<0.05)。

表4 飼糧添加MCE對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 4 Effects of Macleaya cordata extract on the growth performance for weanling piglets kg

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note:In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05), and those with the same letter superscripts or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05),and those with different capital letter superscripts mean extreme difference (P<0.01).The same below.

2.3 MCE對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液免疫參數(shù)和仔豬血清理化指標(biāo)的影響

由圖2(a)可見(jiàn)，60日齡時(shí)，三組MCE添加組血清IgG極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)和土霉素組(P<0.01)，C組血清中IgG含量極顯著高于B、D組(P<0.01)，E組血清IgG極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。但是C組極顯著高于E組(P<0.01)。由圖2(c)可見(jiàn)，C組血清LSZ極顯著高于A組和D組(P<0.01)，E組血清LSZ極顯著高于A、B、C、D組(P<0.01)，A、B組間差異不顯著(P>0.05)。

由圖2(b)可見(jiàn)，LPS刺激后，在加入不同濃度MCE提取物之后，細(xì)胞培養(yǎng)液中IgG含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，并且極顯著高于土霉素組(P<0.01)；土霉素組細(xì)胞培養(yǎng)液中IgG高于對(duì)照組(P<0.01)。由圖2(d)可見(jiàn)，MCE添加組細(xì)胞培養(yǎng)液中LSZ極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；土霉素組與150 ng/mL MCE添加組LSZ含量差異不顯著(P>0.05)，但是150 ng/mL MCE添加組與土霉素組LSZ含量顯著高于50 ng/mL組及100 ng/mL組(P<0.05)。

圖2 斷奶仔豬血清IgG(a)與LSZ(c)及細(xì)胞培養(yǎng)液IgG(b)與LSZ(d)含量變化情況柱狀圖Fig.2 The histogram for IgG (a), LSZ(c) content of weaning piglets serum and IgG (b),LSZ (d) content of cell cultures fluid

2.4 MCE對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化參數(shù)的影響

日糧中添加MCE后血清T-SOD極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且與土霉素組相比差異極顯著(P<0.01)；對(duì)照組血清T-SOD含量極顯著高于土霉素組(P<0.01)。B、C、D組血清MDA含量極顯著低于對(duì)照組和土霉素組(P<0.01)；MCE添加組間血清MDA含量差異極顯著(P<0.01)，C組極顯著低于B和D組(P<0.01)；土霉素組MDA含量極顯著高于對(duì)照組和MCE添加組(P<0.01)。MCE添加組GSH-Px與空白對(duì)照組差異不顯著，但土霉素組都極顯著高于其他四組(P<0.01)。

3 討 論

3.1 MCE對(duì)腸道病原微生物的抑制作用

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MCE對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌高度敏感，對(duì)沙門(mén)氏菌中度敏感；MCE對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1280、1280、2560、2560 μg/mL。有研究報(bào)道，MCE中血根堿在pH為6.5時(shí)對(duì)變形鏈球菌、齲齒鏈球菌、血鏈球菌、粘性鏈球菌及內(nèi)氏放線的最低抑制濃度在4～8 μg/mL之間，并且氫離子濃度影響血根堿的抑菌活性，在抑菌活性方面血根堿與鋅具有協(xié)同作用[5]。除了抑制細(xì)菌之外，MCE對(duì)真菌也有不同抑制作用，李靜[6]等用MCE制成血根堿酊劑，以維達(dá)寧為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定其對(duì)4種皮癬真菌抑制效果，結(jié)果表明，血根堿酊劑對(duì)4種皮癬真菌均具較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)須癬毛癬菌和許蘭黃癬菌的抑制作用尤為明顯。Vrublova1[7]用糖酐酯誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生大腸炎，結(jié)果表明，含有MCE的飼料添加劑組能減小直腸粘膜損傷，降低直腸髓過(guò)氧化物酶活性及環(huán)氧化酶2蛋白水平。劉靖[8]研究發(fā)現(xiàn)，MCE可以促進(jìn)黃雞小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育，改善小腸的消化吸收功能。說(shuō)明MCE可能是通過(guò)抑制腸道有害微生物的生長(zhǎng)來(lái)促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體腸道內(nèi)健康微生物菌群的形成，降低腸道pH值，從而阻止了病原微生物在腸內(nèi)的生殖，增加了動(dòng)物機(jī)體對(duì)外源性病原菌的抵抗作用。上述報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，其影響程度與作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

表5 MCE對(duì)血清 T-SOD，MDA 和GSH-Px含量的影響Table 5 Effect of Macleaya cordata extract on blood T-SOD，MDA and GSH-Px for weaned piglets

3.2 MCE改善斷奶仔豬生產(chǎn)性能

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，適宜水平的MCE添加于基礎(chǔ)飼料中，對(duì)斷奶仔豬的生產(chǎn)性能有不同程度的改善。在35～60日齡，基礎(chǔ)日糧中添加2.5、5、7.5 mg/kg MCE，對(duì)仔豬的平均日增重，平均日采食量及料重比的改善效果明顯優(yōu)于土霉素。這一結(jié)果與蔡鵬[9]等報(bào)道的，三元仔豬日糧中苯并啡啶類(lèi)生物堿的添加量0.675 mg/kg(以血根堿+白屈菜紅堿總生物堿計(jì))為理想劑量不一致。但是MCE能提高日增重，降低料重比，這一結(jié)果與饒華[10]等研究結(jié)果一致，結(jié)果提示我們，MCE適宜添加量可能與豬品種和日糧組成及有效成分含量有關(guān)。其適宜添加水平有待于進(jìn)一步研究。

3.3 MCE對(duì)仔豬血清及細(xì)胞培養(yǎng)液免疫應(yīng)激參數(shù)的影響

IgG是動(dòng)物自然感染和人工主動(dòng)免疫后機(jī)體產(chǎn)生的主要抗體，是動(dòng)物機(jī)體抗感染的主力，在體內(nèi)發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)中，隨日糧MCE添加水平提高，仔豬血清中IgG含量也升高，日糧中添加5 mg/kg MCE與空白對(duì)照組相比顯著提高了血清中IgG含量(P<0.01)且與土霉素組相比也有顯著提高(P<0.01)，說(shuō)明MCE能顯著提高仔豬血清中IgG含量，從而達(dá)到提高斷奶仔豬自身免疫能力，抵御外界微生物入侵，增強(qiáng)斷奶抗病能力。仔豬在斷奶時(shí)會(huì)有斷奶應(yīng)激出現(xiàn)，此時(shí)，斷奶應(yīng)激可降低仔豬體循環(huán)抗體水平，抑制細(xì)胞免疫能力。MCE提高血清IgG則有利于減小斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬的影響，提高成活率。另外，細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，MCE添加組IgG含量高于對(duì)照組和土霉素組(P<0.01)，土霉素組也顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明MCE和土霉素均能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IgG。其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

LSZ有較寬的抑菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有滅殺作用，另外，并能改善細(xì)胞抑制劑所導(dǎo)致的白細(xì)胞減少，結(jié)合細(xì)菌LPS，減輕內(nèi)毒素作用，從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，提高動(dòng)物的健康水平。在畜禽養(yǎng)殖中，溶菌酶可以提高仔豬生產(chǎn)性能、降低腹瀉率，增強(qiáng)免疫力[11]。本試驗(yàn)中，添加5 mg/kg MCE和土霉素組相較于不添加組，血清中LSZ分別提高了20.7%和47.9%，說(shuō)明MCE和土霉素都能提高機(jī)體LSZ活力，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力，但與土霉素相比，MCE為天然植物產(chǎn)物，不存在使用過(guò)后耐藥性、藥物殘留等問(wèn)題，對(duì)于解決抗生素使用帶來(lái)的問(wèn)題具有積極意義。另外，細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，適宜MCE添加組LSZ含量高于對(duì)照組和土霉素組，但差異不顯著。

3.4 MCE對(duì)仔豬血清抗氧化參數(shù)的影響

機(jī)體抗氧化防御體系中，T-SOD和GSH-Px對(duì)氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要作用。本試驗(yàn)中，添加MCE組仔豬血清中總SOD顯著高于對(duì)照組和土霉素組(P<0.01)，而血清中GSH-Px含量與對(duì)照組持平，卻低于土霉素組(P<0.05)，說(shuō)明GSH-Px可能處于被抑制狀態(tài)。有研究表明，在機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)內(nèi)可能存在著某種動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制，作為抗氧化系統(tǒng)的SOD和GSH-Px在某種狀況下并非同時(shí)增加，而是一種機(jī)制激活時(shí)，另一種可能處于被抑制狀態(tài)[12]。其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，其含量的高低間接反映機(jī)體受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)MCE添加組仔豬血清中MDA極顯著低于對(duì)照組和土霉素組(P<0.01)，說(shuō)明MCE提取物能夠保護(hù)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞，降低氧自由基對(duì)機(jī)體的損害。

4 結(jié) 論

MCE對(duì)腸道致病菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌都有抑制作用；MCE能顯著改善斷奶仔豬生產(chǎn)性能，提高血清IgG、T-SOD，降低血清MDA含量，增強(qiáng)仔豬抗病力及抗氧化能力；并能緩解細(xì)胞應(yīng)激的損傷。提示MCE可以替代抗生素應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pavel Kosina，Jana Gregorova. Phytochemical and antimicrobial characterization of Macleaya cordata herb[J]. Fitoterapia,2010,81(8):1 006-1 012.

[2] 萬(wàn)學(xué)攀.博落回生物堿成分分離及抑菌活性研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[3] 何夏陽(yáng).血根堿對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和血液生化指標(biāo)的影響[D].湖南長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[4] 駱 雪.云南特有豬種β-defensin基因表達(dá)特點(diǎn)及外源活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用[D].云南昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[5] 郁建生.博落回制劑對(duì)禽霍亂、仔豬白痢的對(duì)比治療試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007,2:91-93.

[6] 李 靜,范家佑，郁建平,等.血根堿酊劑體外抗真菌初步研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2011,30(4):348-351.

[7] Vrublova E.The phytogenic feed additive Sangrovit modulates dextran sulfate sodium-induced colitis in rats[J]. Veterinarni Medicina, 55, 2010 (12): 610-618.

[8] 劉 靖.博落回生物堿對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)的影響[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[9] 蔡鵬,孫志良,曾建國(guó)，等.不同劑量博落回提取物對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010,37(5)：41-43.

[10] 饒 華，蔡 鵬，周錫紅，等.博落回提取物對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響[J].中國(guó)獸藥雜志. 2009,43(11)：42-43.

[11] 盧亞萍,潘宏濤,紀(jì)孫瑞，等.溶菌酶對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能及血清生化指標(biāo)的影響[J].養(yǎng)豬，2010,(4)：30-31.

[12] 張軍民.谷氨酰胺對(duì)早期斷奶仔豬腸道的保護(hù)作用及其機(jī)理研究[D] .北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2000.