馬 力，楊麗梅，徐倩倩，郭時金，沈志強*，柳增善

( 1.吉林大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130062;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州 256600 )

銀黃制劑是指由金銀花提取物和黃芩提取物制備而成的中藥制劑，主要有銀黃口服液、銀黃注射液和銀黃顆粒劑；獸用銀黃制劑主要有銀黃口服液和銀黃注射液。銀黃顆粒系根據(jù)其口服液改型而成，是由綠原酸和黃芩提取物制成的復(fù)方制劑,具有清熱疏風(fēng),利咽解毒,抗菌消炎之功效[1]，獸醫(yī)臨床上主要用于治療和預(yù)防雞傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎所致的肺熱咳喘等疾病，是目前用于預(yù)防禽流感的六大藥物之一，臨床上被廣泛應(yīng)用。為嚴格控制產(chǎn)品質(zhì)量,保證藥物預(yù)防和治療疾病的效果，本研究建立了一套運用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatographg,HPLC)法測定銀黃顆粒中的有效成分綠原酸、黃芩苷含量的測定方法,并從標準曲線、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等方面對該方法進行了方法學(xué)考證。通過對試驗數(shù)據(jù)科學(xué)的分析觀察,該法具有測定方法簡便、數(shù)據(jù)準確性好和重現(xiàn)性好的特點，可以實現(xiàn)對銀黃顆粒質(zhì)量的有效控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent1260系列高效液相色譜儀;G1329B自動進樣器、G1314F可變波長檢測器、Agilent Chemstation色譜工作站);千萬分之一電子天平(梅特勒);SB3200型超聲波清洗器(上海新芝生物技術(shù)研究所);Millipore超純水系統(tǒng)。乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、磷酸(分析純，煙臺市雙雙化工廠)。綠原酸對照品(購自中國藥品生物制品檢定所,批號為110753-201117,含量為96.60%，用于含量檢測)、黃芩苷對照品(購自中國藥品生物制品檢定所,批號為110715-201105,含量為94.00%，用于含量測定)、銀黃顆粒制劑(本公司實驗室自制)。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)試用性試驗 色譜柱:十八烷基硅烷基鍵合硅膠柱4.6 mm×250 mm;流動相:乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90)和甲醇-水-0.2%磷酸(50∶50∶0.2);綠原酸檢測波長為327 nm；黃芩苷檢測波長為274 nm;流速:1.00 mL/min，柱溫:30℃。在此條件下，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計為8 000,按黃芩苷峰計為6 000。綠原酸和黃芩苷色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5。結(jié)果顯示，在上述波長下樣品色譜峰分離度很好，并且陰性供試品溶液對綠原酸和黃芩苷的測定無干擾。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備

(1)綠原酸對照品儲備液的制備。精密稱取60 ℃減壓干燥至恒重的綠原酸對照品8.40 mg,置于10 mL棕色量瓶中,加入適量50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,備用[3]。精密量取對照品儲備液1 mL,置10 mL棕色量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得含綠原酸對照品0.084 mg/mL溶液。

(2)黃芩苷對照品。精密秤取105 ℃干燥至恒溫的黃芩苷對照品6.5 mg,加入25 mL量瓶中并用適量50%甲醇溶解并稀釋至25 mL,搖勻,即得黃芩苷對照品0.260 mg/mL溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取銀黃顆粒0.2 g, 精密稱定，用研缽研細,置具塞三角瓶中,精密加50%的甲醇50 mL,稱重，超聲提取15 min,放置室溫后放冷，再稱量后用50%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻，過濾，取續(xù)濾液備用[4]。精密移取1 mL置于10 mL量瓶中加50%甲醇至刻度，混勻，作為供試品溶液。按上述方法制備不含綠原酸和黃芩苷的陰性樣品溶液。

1.3 專屬性考察

分別制備不含金銀花提取物陰性對照品和不含黃芩提取物陰性對照品溶液,依法進樣測定[5]?？疾毂疚拇_定的測定條件下,綠原酸和黃芩苷的測定是否受干擾。

1.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取綠原酸對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，黃芩苷對照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,在上述色譜條件下分別進樣并記錄峰面積,以對照品進樣量(μg)為橫坐標，相應(yīng)的峰面積為縱坐標,進行線性回歸。

1.5 精密度試驗

按上述色譜條件,取綠原酸和黃芩苷對照品溶液分別進樣6次,測得峰面積積分值進行計算綠原酸的RSD。

1.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批(20121023)樣品，按1.2.2制備方法分別制備5份，分別于1,3,6,12,24 h進樣測定,每次進樣10 μL[6]。測定峰面積值,綠原酸峰面積積分值RSD。

1.7 重現(xiàn)性試驗

取同一批(批號:20121023)樣品，按1.2.2制備方法分別制備6份供試品，按上述色譜條件測定。測定峰面積值,綠原酸和黃芩苷峰面積積分值RSD。

鈣硫比的增加對所獲得的粉煤灰脫硫活性起到促進作用，但CaCO3的增加必然對爐內(nèi)煤粉燃燒特性產(chǎn)生影響，若其加入嚴重影響煤粉燃燒特性，那么對上述研究就失去了意義。為此，筆者進一步針對鈣硫比對煤粉燃燒特性的影響進行研究。

1.8 回收率試驗

1.8.1 綠原酸回收率試驗 精密秤取同一批(批號20121023)的樣品5份,加入量瓶中,分別精密加入一定量的綠原酸對照品儲備溶液,按供試品溶液制備方法制備并測定[7],計算回收率。

1.8.2 黃芩苷回收率試驗 精密秤取同一批(批號20121023)的樣品細粉5份,加入量瓶中,分別精密加入一定量的黃芩苷對照品儲備溶液,按供試品溶液制備方法制備并進行測定,計算回收率。

1.9 樣品含量測定

對照1.2.2項下的方法制備供試品溶液,依法進樣測定,共分析三批樣品。計算樣品中綠原酸和黃芩苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

綠原酸對照品、供試樣品色譜圖、不含有金銀花提取物色譜圖及黃芩苷對照品、供試樣品色譜圖、不含有黃芩提取物色譜圖分別見圖1-6。表明在本研究確定的測定條件下,綠原酸和黃芩苷的測定不受干擾。

圖1 綠原酸對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of Chlorogenic acid

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the test sample

2.2 線性關(guān)系考察

綠原酸的回歸方程為Y=15343.5X-235.42，r=0.9997(n=6)，在0.336～3.36 μg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系； 黃芩苷的回歸方程為Y=28541.9X-85.243，r=0.9996(n=6)，在0.130～130 μg/mL有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗結(jié)果

按上述色譜條件,取綠原酸和黃芩苷對照品溶液分別進樣6次,測得峰面積積分值進行計算綠原酸的RSD=1.12%(n=6)。黃芩苷的RSD=1.01%(n=6)，結(jié)果表明該測定方法具有良好的精密度。

圖3 陰性樣品(不含金銀花提取物)色譜圖Fig.3 Chromatogram of the negative control(omit Lonicera japonica extract)

圖4 黃芩苷對照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of baicalin

圖5 供試品色譜圖Fig.5 Chromatogram of the test sample

圖6 陰性樣品(缺黃芩提取物)色譜圖Fig.6 Chromatogram of the negative control (omit scutellaria extract)

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

綠原酸的含量RSD=1.15%(n=6),黃芩苷的含

量RSD=0.43%(n=6),表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 回收率試驗結(jié)果

2.6.1 綠原酸回收率 樣品中綠原酸回收率結(jié)果見表1。

2.6.2 黃芩苷回收率 樣品中黃芩苷回收率見表2。

2.7 樣品含量測定結(jié)果

三批樣品中綠原酸和黃芩苷測定結(jié)果見表3。

表1 綠原酸回收率試驗結(jié)果(n=5)Table 1 The results of recovery rate of Chlorogenic acid (n=5)

表2 黃芩苷回收率試驗結(jié)果(n=5)Table 2 The results of recovery rate of baicalin (n=5)

表3 三批樣品含量的測定結(jié)果 Table 3 Contents of chlorogenic acid and Baicalin in three batches of samples

3 討 論

高效液相色譜法測定銀黃顆粒劑中綠原酸,之前曾篩選過乙腈-0.4%磷酸(30∶70),(20∶80),后將比例調(diào)至(10∶90)分離效果較好;之前曾篩選過甲醇-水-0.1%磷酸(50∶50:0.4),甲醇-水(1∶1),甲醇-水-0.4%(50∶50∶0.4),結(jié)果均不理想,最后采用甲醇-水-0.2%磷酸(50∶50∶0.2)分離效果較好，并能獲得很好的柱效，峰形和分離度都很好[8]。

應(yīng)用HPLC法對銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量進行測定,經(jīng)方法學(xué)研究表明此方法簡便易行,準確度高,精密度、靈敏度等指標符合要求?？勺鳛殂y黃顆粒的質(zhì)量標準的檢測方法提供可靠的參考依據(jù)，并能確保產(chǎn)品質(zhì)量。

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，綠原酸對照品溶液穩(wěn)定性較差，放置時間過長，會產(chǎn)生部分有效成分分解，影響樣品含量檢驗的準確度，因此在配制綠原酸對照品時，采用棕色量瓶，提高綠原酸對照品溶液的穩(wěn)定性，保證測定樣品含量的準確度。

4 結(jié) 論

本研究中建立的HPLC法具有樣品處理簡便、色譜分離度、重現(xiàn)性好的特點，可用于銀黃顆粒制劑質(zhì)量的控制。

參考文獻:

[1] 李宇清，劉勁松.HPLC測定銀黃顆粒劑中綠原酸和黃芩苷的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2004,18(5)：45-47.

[2] 趙秀香，李啟艷，王 磊.HPLC法測定銀黃注射液中綠原酸的含量[J].藥物分析雜志,2006,26(12):1 880-1 882.

[3] 胡春湘,陳忠梁,張正光.HPLC測定銀黃片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中成藥雜志,2003,25(5):418.

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[5] 張冬梅，桑 媛，劉 冰.HPLC法同時測定雙黃連注射液中綠原酸及黃芩苷含量[J].藥物分析雜志，2005,25(10)：1 279-1 280.

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[7] 袁 浩，劉永利，李冬梅.HPLC法測定銀黃片中綠原酸與黃芩苷含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010，10(17)：61-62.

[8] 鐘英杰，李 亮，徐福亮. HPLC法同時測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷含量的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010(8)：104-105.