魏 楊，徐亞鉑，劉向波，康相濤,2，田亞?wèn)|,2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程中心，河南 鄭州 450000)

膽固醇，被稱為膽甾醇[1]，是動(dòng)物細(xì)胞膜的重要成分之一[2]，許多類固醇激素和膽汁酸生成的前體。對(duì)于大多數(shù)組織來(lái)說(shuō)，保證膽固醇的供給，維持其代謝平衡是十分重要的。但相關(guān)研究表明，膽固醇水平的高低與人類健康有著密切的關(guān)系，人體從食物中攝入過(guò)量的膽固醇，會(huì)使血液中膽固醇含量增加，然而高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的重要致病因素之一[3]。美國(guó)相關(guān)研究結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)節(jié)人類膳食中的膽固醇含量，降低血漿中膽固醇含量的1%，可以減少2%的冠心病發(fā)病率[3]。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)是膽固醇合成過(guò)程中的限速酶，在膽固醇合成途徑中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[4]。雞HMGCR基因位于Z染色體上，包含20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子。本研究的目的是探討HMGCR基因多態(tài)性與雞蛋膽固醇含量之間的關(guān)聯(lián)性，從而為培育出一種低膽固醇含量蛋雞新品系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取絲羽烏骨雞健康母雞225只，單籠飼養(yǎng)于相同的管理?xiàng)l件下。30周齡時(shí)連續(xù)采集每個(gè)個(gè)體的雞蛋3枚，用于測(cè)定雞蛋膽固醇含量。在雞蛋收集結(jié)束后，采集每個(gè)個(gè)體翅靜脈血液。利用酚-氯仿法從血液中提取基因組DNA，并溶解于TE中，保存于4℃直至使用。

1.2 雞蛋膽固醇含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5 g蛋黃液用蒸餾水將其定容于50 mL容量瓶中制成原始蛋黃稀釋液。吸取原始蛋黃稀釋液1.0 mL，分別加入95%乙醇3.0 mL和50%氫氧化鉀溶液2.0 mL，置于60℃水浴中皂化60 min。皂化結(jié)束后冷卻，分別加入5.0 mL正己烷和3.0 mL蒸餾水，混合均勻，靜置，直至正己烷與蒸餾水分層清晰。吸取上清液0.5 mL，在40℃下恒溫抽真空干燥，隨后使用0.5 mL甲醇溶解作為高效液相分析樣品。

色譜條件如下：以100%色譜級(jí)甲醇做為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為5 μL，在柱溫38 ℃、流速為1.0 mL/min的條件下，以205 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)混合DNA池測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Exon17及Exon18內(nèi)分別含有一個(gè)突變位點(diǎn)，將其命名為g.12217G>T和 g.12684T>C。使用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

1.4 PCR擴(kuò)增及CRS-PCR-RFLP

PCR反應(yīng)體系為25 μL體系：2×Taq MasterMix 12.5 μL，引物 (10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57.7°C (g.12217G>T) or 62 ℃ (g.12684T>C)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

CRS-PCR-RFLP反應(yīng)條件為：10 μL PCR產(chǎn)物、10 U限制性內(nèi)切酶、2 μL buffer和7.7 μL的 ddH2O混合，37 ℃過(guò)夜。酶切產(chǎn)物均使用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Regression對(duì)雞蛋中膽固醇含量做回歸方程。根據(jù)電泳結(jié)果計(jì)算基因型頻率及等位基因頻率。使用PopGene 32軟件(population genetic analysis, version 1.31)計(jì)算該群體的遺傳變異。根據(jù)公式計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content , PIC)[5]及雜合度(heterozygosity, H)[6]。利用SPSS 17.0中的一般線性模型分析不同基因型與相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)性。模型如下：

Y =μ+ G+E

式中：Y為個(gè)體表型值，μ為群體均值，G為標(biāo)記基因型效應(yīng)，E為隨機(jī)誤差；成對(duì)比較采用SPSS17.0分析軟件Borferroin法。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲羽烏骨雞蛋膽固醇含量測(cè)定

對(duì)225只30周齡絲毛烏骨雞所產(chǎn)的675枚蛋進(jìn)行雞蛋膽固醇含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶液(a)及蛋黃樣品(b)的高效液相色譜分離結(jié)果見(jiàn)圖1。在選擇的色譜條件下，膽固醇的保留時(shí)間為9 min。以膽固醇濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽固醇工作液上樣，上樣量為5 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)Y、膽固醇濃度為橫坐標(biāo)X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)，并進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=2258X+12.33，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。根據(jù)此公式計(jì)算出蛋黃中膽固醇含量及全蛋中膽固醇含量(表2)。

表2 絲羽烏骨雞雞蛋膽固醇含量測(cè)定Table 2 The determination silkies' egg cholesterol

圖1 高效液相色譜圖 Fig.1 HPLC Finger Print a.標(biāo)準(zhǔn)膽固醇樣品；b.蛋黃樣品a.Standard cholesterol samples；b.Egg yolk sample

圖2 膽固醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 The standard curve of cholesterol

2.2 雞HMGCR基因遺傳變異的檢測(cè)

為了在雞HMGCR基因的PCR產(chǎn)物中創(chuàng)造HinfI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，在g.12217G>T引物對(duì)的下游引入一個(gè)錯(cuò)配位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)消化后使用3.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分型，酶切圖片顯示了三種基因型，分別被命名為GG (141+21)bp, GT (162+141+21)bp, TT (162bp)；采用導(dǎo)入Eco88I限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)的方法，對(duì)g.12684T>C突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR-RFLP。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切消化后后，使用3.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，酶切結(jié)果顯示三種帶型，分別命名CC (250+22)bp, CT (272+250+22)bp, TT (272bp)，如圖3所示。

2.3 群體遺傳學(xué)分析

該群體遺傳學(xué)分析見(jiàn)表3。由表3可知：群體中g(shù).12217G>T突變位點(diǎn)的TT基因型頻率(0.084)和T等位基因頻率(0.477)較低；g.12684T>C突變位點(diǎn)TC基因型個(gè)體出現(xiàn)的頻率(0.829)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種基因型。G.12217G>T和g.12684T>C兩個(gè)突變位點(diǎn)的雜合度為中等水平，可知這兩個(gè)等位基因群體內(nèi)遺傳變異的程度不大；多態(tài)信息含量值均為中度多態(tài)(0.5>PIC>0.25)。

圖3 HMGCR基因酶切產(chǎn)物電泳圖(3.0%瓊脂糖) Fig. 3 3.0% agarose gel electrophoresis for digesting HMGCR gene PCR Product

表3 群體中兩個(gè)SNPs位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析Table 3 Population genetic analysis of the two SNPs in the population

2.4 HMGCR基因各突變位點(diǎn)與絲毛烏骨雞蛋膽固醇含量的關(guān)聯(lián)分析

g.12217G>T及g.12684T>C突變位點(diǎn)不同基因型與絲毛烏骨雞蛋膽固醇含量之間的關(guān)聯(lián)性分析見(jiàn)表4。G.12217G>T突變位點(diǎn)僅對(duì)雞蛋中膽固醇含量具有顯著的影響(P<0.1)，GG基因型雞蛋中膽固醇含量顯著低于其他兩種基因型。G.12684T>C突變位點(diǎn)僅對(duì)蛋黃重具有顯著影響(P<0.1)，CC基因型的蛋黃重最大。

3 討 論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們消費(fèi)水平極大提高及膳食中動(dòng)物性食品比重的逐漸增加, 人們?cè)谧非笮螽a(chǎn)品數(shù)量的同時(shí)，對(duì)其風(fēng)味、感觀滿意程度及保健功能也提出了更高的要求[7]。雞蛋是人們?nèi)粘１貍涞膭?dòng)物性食品之一，但雞蛋中較高的膽固醇含量都已成為制約市場(chǎng)需求量的重要因素。

3.1 膽固醇在產(chǎn)蛋雞體內(nèi)的代謝

體內(nèi)膽固醇的來(lái)源分為外源性吸收和內(nèi)源性合成兩部分。外源性吸收主要源于飼料，內(nèi)源性合成主要源于肝臟。產(chǎn)蛋雞的脂質(zhì)代謝與哺乳動(dòng)物不同，產(chǎn)蛋雞攝入的飼料以植物飼料為主，所以產(chǎn)蛋雞從飼料中攝入的膽固醇含量很少，其主要是通過(guò)自身的膽固醇合成來(lái)滿足自身生理及生產(chǎn)的需要。蛋雞每天合成約300 mg膽固醇，其中大約2/3沉積在雞蛋中[8]，10 mg左右直接排入腸道[9]，其余的則發(fā)生轉(zhuǎn)化(如類固醇激素、維生素D3等)和形成膜結(jié)構(gòu)。對(duì)于產(chǎn)蛋雞而言，肝臟和卵巢是合成膽固醇的主要場(chǎng)所。肝臟不僅是脂質(zhì)合成速度最快，也是合成量最多的器官，是機(jī)體最活躍的合成部位和血漿中膽固醇的主要來(lái)源[8]。膽固醇合成過(guò)程比較復(fù)雜，有近30步反應(yīng)，整個(gè)過(guò)程可分為3個(gè)階段[10]。乙酰CoA是膽固醇合成的直接原料，它來(lái)自葡萄糖、脂肪酸及某些氨基酸的代謝產(chǎn)物。另外，還需要腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)供能和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供氫進(jìn)行一系列的氧化還原反應(yīng)，經(jīng)過(guò)生成HMG-CoA、甲羥戊酸、鯊烯、羊毛固醇等中間產(chǎn)物，最終生成膽固醇。合成1分子膽固醇需消耗18分子乙酰輔酶A、36分子ATP和16分子NADPH。其中HMGR-CoA還原酶在生成甲羥戊酸這一過(guò)程中決定了合成反應(yīng)的快慢，也是外界調(diào)控體內(nèi)膽固醇合成的主要靶點(diǎn)。

表4 HMGCR基因g.12217G>T和g.12684T>C不同基因型與雞蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Associations of g.12217G>T and g.12684T>C genotypes of the HMGCR gene with egg traits

3.2 HMGCR基因兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與雞蛋膽固醇含量相關(guān)性分析

隨著人的老齡化，心血管疾病逐漸成為威脅人類健康的殺手，臨床和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心血管疾病的重要因素，而高脂、高膽固醇膳食與動(dòng)脈粥樣硬化有著密切關(guān)系。膳食膽固醇(CHOL)主要來(lái)源于動(dòng)物性食物，雞蛋是動(dòng)物性食品中CHOL含量較高的一種，平均213 mg/枚[11]。1972年，美國(guó)膳食研究委員會(huì)采納了美國(guó)心臟研究協(xié)會(huì)的觀點(diǎn)，建議每天攝入膽固醇應(yīng)少于300 mg，為遵循這一建議，每周食用全蛋不宜超過(guò)3枚[12]。人們由于擔(dān)心膽固醇過(guò)高會(huì)引起動(dòng)脈粥樣硬化，從而減少了雞蛋的食用，這就是美國(guó)和加拿大雞蛋消費(fèi)下降的重要原因[11]。

陸俊賢等[13]對(duì)我國(guó)7個(gè)品種蛋雞的雞蛋膽固醇含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國(guó)地方雞種雞蛋的膽固醇含量平均約為196 mg/枚，低于國(guó)外雞種，但是差異不明顯。楊朋坤[14]對(duì)四個(gè)品種雞蛋的膽固醇含量進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲羽烏雞蛋的膽固醇含量最高，31周齡絲羽烏骨雞雞蛋膽固醇含量約為262.9339 mg/100 g雞蛋。本試驗(yàn)中絲毛烏骨雞雞蛋的膽固醇含量平均約為456.6 mg/100 g 雞蛋，明顯高于他們的研究結(jié)果，由于不同的飼養(yǎng)環(huán)境及飼糧組成的差異所造成的偏差。

孫憲如[15]建議在降低膽固醇方面應(yīng)該利用雜交優(yōu)勢(shì)，選擇膽固醇含量最低的蛋作為種蛋，可使后代所產(chǎn)蛋中膽固醇含量降低5%～7%。CaPo(1995)報(bào)道通過(guò)雜交得到的品種每克蛋黃膽固醇含量和其他與之相比較的品種間差異顯著。蛋黃膽固醇濃度的值變異較大，大約為20%～40%，蛋黃中膽固醇的含量與遺傳具有一定的關(guān)系，其遺傳力約為0.21～0.26[16]，且性狀的表達(dá)受環(huán)境因素影響較大，通過(guò)常規(guī)遺傳育種手段很難有效穩(wěn)定地降低蛋黃膽固醇，因此我們需要通過(guò)選育或基因突變來(lái)獲得產(chǎn)低膽固醇雞蛋的新品系[17-19]。

蛋黃膽固醇濃度或雞蛋膽固醇含量為數(shù)量性狀其表達(dá)受一系列微效基因的調(diào)控，其中包括3-甲基-3-羥基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)基因[20]、載脂蛋白B(APo-B)基因、卵母細(xì)胞卵黃生成受體(OVR)基因等[21]。HMGCR是機(jī)體合成膽固醇過(guò)程中的限速酶，APo-B在血液中與膽固醇結(jié)合，起到運(yùn)輸?shù)淖饔?，而OVR則通過(guò)內(nèi)吞作用介導(dǎo)脂蛋白完整轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入生長(zhǎng)中的卵母細(xì)胞，最后使膽固醇沉積在蛋黃中。從這些基因中尋找出影響膽固醇含量的分子標(biāo)記，然后對(duì)低膽固醇品系進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，對(duì)加快選育進(jìn)程具有重要的作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中HMGCR基因g.12217G>T位點(diǎn)與雞蛋中膽固醇含量顯著相關(guān)，其中GG基因型個(gè)體顯著小于GT基因型和TT基因型個(gè)體；HMGCR基因g.12684T>C位點(diǎn)對(duì)蛋黃重具有顯著的影響，其中CC基因型個(gè)體顯著大于TT基因型和TC基因型個(gè)體，將這兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果結(jié)合在一起，我們可以得到野生型個(gè)體雞蛋的蛋黃重且雞蛋中膽固醇含量低，這一結(jié)論有利于日后對(duì)產(chǎn)低膽固醇雞蛋新品種的選育，可以避免雞蛋中膽固醇含量高但蛋黃小這一缺點(diǎn)，可以更好地滿足消費(fèi)者的消費(fèi)心理。

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