姜春燕，譚 勇，呂 誠(chéng)，李 立，李 健，張廣中，李元文，姜 淼，韓學(xué)杰，呂愛(ài)平△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，北京 100010;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)學(xué)系，北京 100029;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院皮膚科，北京 100078)

銀屑病俗稱牛皮癬，中醫(yī)古稱白疕，是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，屬于皮外科的疑難雜癥之一。臨床實(shí)踐證明，中醫(yī)辨證論治銀屑病能夠取得良好療效，而與西醫(yī)診治具有互補(bǔ)性。既往我們對(duì)銀屑病的中醫(yī)證候分類規(guī)律和用藥規(guī)律進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)血熱證是銀屑病最常見(jiàn)的證型，生地黃是治療其最常用的中草藥［1］?；谖覀兗韧W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基礎(chǔ)［2，3］，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，預(yù)測(cè)生地黃治療銀屑病的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，為探索中藥多靶點(diǎn)治療病證的機(jī)制研究提供方法學(xué)參考。

1 材料與方法

從中華人民共和國(guó)藥典(2005版)中查詢生地黃的有效成分，從美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所(NIH)建立的小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.Ncbi.him.nih.gov)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)分別檢索生地黃各個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)人類活性靶蛋白和銀屑病相關(guān)基因(檢索日期:2012年8月29日)，將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，運(yùn)行“core analysis”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并得到相關(guān)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 生地黃靶蛋白及靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表1顯示，通過(guò)檢索PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)找到生地黃共有7個(gè)靶蛋白。通過(guò)IPA軟件構(gòu)建這些靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)主要展示“與癌癥形成及細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡相關(guān)的分子”相互關(guān)系特征，提示這些靶蛋白參與癌癥形成及細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的調(diào)控。

表1 生地黃靶標(biāo)蛋白

2.2 銀屑病相關(guān)基因生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)及功能

表2顯示，通過(guò)檢索 gene數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到165個(gè)銀屑病相關(guān)基因。把這些基因?qū)隝PA軟件，共能構(gòu)建15個(gè)分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，這些分子主要涉及3個(gè)經(jīng)典通路，其中涉及銀屑病相關(guān)基因最多的是網(wǎng)絡(luò)(圖2)中的基因及核轉(zhuǎn)錄因子 κB(Nuclear Factor Kappa binding，NF-κB)信號(hào)通路(圖 4)中的相關(guān)基因。圖2主要展示“與皮膚炎癥、結(jié)締組織病變相關(guān)的分子”相互關(guān)系特征，提示這些基因參與皮膚炎癥、結(jié)締組織的調(diào)控。

圖1 生地黃靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與分子網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)通路

在IPA系統(tǒng)的Comparison功能中，比較銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的分子網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)通路。圖3顯示，腫瘤抑制蛋白(TP53)、核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP1)及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)是銀屑病和生地黃共同關(guān)聯(lián)的分子，提示生地黃可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)這些分子對(duì)銀屑病發(fā)揮治療作用。圖4顯示，NF-κB信號(hào)通路是銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的生物學(xué)通路，但它們作用的靶點(diǎn)并不盡相同，提示生地黃靶蛋白GSK3B通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路對(duì)銀屑病發(fā)揮治療作用。

表2 銀屑病相關(guān)主要基因

圖2 銀屑病相關(guān)基因分子網(wǎng)絡(luò)

圖3 “生地黃靶蛋白-銀屑病相關(guān)基因”分子網(wǎng)絡(luò)

3 討論

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein Interaction Network)是研究生物功能或病理變化分子基礎(chǔ)的新途徑和新方法，也是目前國(guó)際上生物信息學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［4，5］。發(fā)現(xiàn)并建立與疾病相關(guān)的分子作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于認(rèn)識(shí)復(fù)雜疾病至關(guān)重要，也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究所面臨的重大挑戰(zhàn)［6］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基本思路是理解疾病“表型-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)特征，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，尋找可能的組合藥物靶標(biāo)，預(yù)測(cè)最優(yōu)化的組合藥物［2］?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵技術(shù)研究，對(duì)于預(yù)測(cè)藥效及藥理機(jī)制既是方法學(xué)創(chuàng)新，又具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益［7］。許多復(fù)雜性疾病，如心血管疾病、腫瘤、糖尿病、銀屑病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊亂而形成的疾病網(wǎng)絡(luò)。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)及系統(tǒng)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)功能特征，探索中藥對(duì)疾病的調(diào)控機(jī)制與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路有許多相似之處［8］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探索生地黃治療銀屑病的分子機(jī)制。

圖4 銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的NF-κB信號(hào)通路

PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)和Gene數(shù)據(jù)庫(kù)是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)建立的公共數(shù)據(jù)庫(kù)［9］。通過(guò)其中豐富的化合物、生物活性信息和疾病相關(guān)基因信息，以及數(shù)據(jù)庫(kù)自身對(duì)這些信息進(jìn)行整合分析的功能，檢索生地黃有效成分靶蛋白和銀屑病相關(guān)基因作為我們構(gòu)建生地黃靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和銀屑病疾病網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)。IPA生物分析軟件能夠分析、整合、理解來(lái)自于基因表達(dá)等系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)品和藥物的信息，并能建立起實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的交互模型［10］。在本研究中，我們除了利用IPA平臺(tái)構(gòu)建生地黃靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和銀屑病疾病網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)利用 IPA軟件中Comparison Analysis的分析功能對(duì)這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)二者網(wǎng)絡(luò)的異同點(diǎn)以及二者生物學(xué)通路的異同點(diǎn)，進(jìn)而尋找生地黃治療銀屑病的生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，生地黃可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)TP53、NF-κB、TNF、MMP1 和 MMP2 五個(gè)分子，以及重組人糖原合成酶激酶3β(GSK3B)參與的 NF-κB信號(hào)通路對(duì)銀屑病發(fā)揮治療作用。TP53是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的重要蛋白［11］，能有效地調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的增殖周期，而銀屑病皮損中P53蛋白均表達(dá)異常［12，13］，調(diào)控機(jī)制失去平衡，成為表皮增殖紊亂的重要原因［14］。腫瘤壞死因子(TNF)基因是一種既能直接殺死腫瘤細(xì)胞，又能通過(guò)激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用的細(xì)胞因子。TNF-a出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)初期，是機(jī)體炎癥與免疫反應(yīng)應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中有著重要作用，是銀屑病炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素［15，16］，參與銀屑病的啟動(dòng)、維持和復(fù)發(fā)，且與浸潤(rùn)的細(xì)胞成分及角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖有關(guān)［17］。金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinase，MMPs)是一類結(jié)構(gòu)中含 Zn+和 Ca2+的蛋白水解酶類，是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解主要酶類之一。近年來(lái)有研究表明，MMPs是銀屑病的新生血管形成的重要因素，在銀屑病的發(fā)病中起重要作用［18，19］。NF-κB 是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控眾多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，從而參與調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的生理、病理反應(yīng)［20，21］。免疫介導(dǎo)是銀屑病的主要發(fā)生機(jī)制，銀屑病患者皮損區(qū)一些細(xì)胞因子及黏附分子表達(dá)異常，其中包括 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α 和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)等［22］，而這些因子編碼基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上都有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。慢性銀屑病斑塊中 NF-κB活化缺陷與皮損的形成有關(guān)［23］。NF-κB p65 的異常表達(dá)與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)［24，25］。總之，銀屑病疾病位點(diǎn)和生地黃干預(yù)靶點(diǎn)都能體現(xiàn)在相同的分子網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，干預(yù)這些分子網(wǎng)絡(luò)和通路中的相同或不同的關(guān)鍵分子，進(jìn)而影響整個(gè)網(wǎng)絡(luò)或通路的生物學(xué)功能，這也許就是生地黃治療銀屑病的分子生物學(xué)機(jī)制之一。生地黃是治療血熱證銀屑病最主要的中草藥［1］，以藥測(cè)證，可以推斷上述生地黃的作用靶標(biāo)，也可能反映了血熱證的生物學(xué)特征。

總之，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探索中藥治療疾證分子機(jī)制開(kāi)辟了一條高通量途徑，為中藥有效成分篩選及探索效應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而為臨床用藥及新藥研發(fā)提供了新思路和新方法。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍處于起步發(fā)展階段，其研究手段、計(jì)算方法及應(yīng)用軟件還有待進(jìn)一步探索，基于大量數(shù)據(jù)庫(kù)和算法構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)及藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［26］。

［1］姜春燕，譚勇，楊靜，等.利用文本挖掘技術(shù)分析銀屑病中醫(yī)用藥規(guī)律［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(11):28-30.

［2］何小娟，李健，陳杲，等.基于病證結(jié)合的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究與新藥研發(fā)策略［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(11):1271-1273.

［3］牛旭艷，李健，呂誠(chéng)，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎熱證“藥-證對(duì)應(yīng)”機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(8):299-303.

［4］Bailly-Bechet M， BorgsC， Braunstein A， etal. Finding undetected protein associations in cellsignaling by belief propagation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(2):882-887.

［5］Mewes HW，Amid C，Arnold R，et al..MIPS:analysis and annotation of proteins from whole genomes［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(Database issue):D41-44.

［6］王毅，高秀梅，張伯禮，等.論建立基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的現(xiàn)代中藥創(chuàng)制方法學(xué)［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(2):228-231.

［7］李梢.網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo):中藥方劑網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的一個(gè)切入點(diǎn)［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(15):2017-2020.

［8］Zhao SW，Li S.Network-based relating pharmacological and genomic spaces for drug target identification［J］.Plos One，2010，5(7):e11764.

［9］Henderson-Maclennan NK，Papp JC，Talbot CC Jr，McCabe ER，Presson AP.Pathway analysis software:annotation errors and solutions［J］.Mol Genet MeTab，2010，101(2-3):134-140.

［10］Goronzy JJ，Weyand CM.T-cell regulation in rheumatoid arthritis［J］.Curr Opin Rheumatol，2004 ，16(3):212-217.

［11］Oren M.Regulation of the p53 tumor suppressor protein［J］.J Biol Chem，1999，274(51):36031-36034.

［12］李新華，張開(kāi)明，康玉英.銀屑病患者T細(xì)胞對(duì)表皮c-myc、bcl-2及p53蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華皮膚科雜志，2004，37(3):147-149.

［13］倪曉，孫建方，曾學(xué)思，等.c-myc、p53和 bcl-2與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡異常關(guān)系的研究［J］.中華皮膚科雜志，2000，33(4):240-242.

［14］Soini Y， KamelD， P－－kk9P， LehtoVP， OikarinenA，V－h(huán)－kangas KV.Aberrant accumulation of p53 associates with Ki67 and mitotic count in benign skin lesions［J］. Br J Dermatol，1994，131(4):514-520.

［15］Huber M，Rettler I，Bernasconi K，F(xiàn)renk E，Lavrijsen SP，Ponec M，Bon A，Lautenschlager S，Schorderet DF，Hohl D［J］.Mutations of keratinocyte transglutaminase in lamellar ichthyosis Science，1995，267(5197):525-528.

［16］Compton JG，DiGiovanna JJ，Santucci SK，Kearns KS，Amos CI，Abangan DL，Korge BP，McBride OW，Steinert PM，Bale SJ.Linkage of epidermolytic hyperkeratosis to the type II keratin gene cluster on chromosome 12q［J］.Nat Genet，1992，1(4):301-305.

［17］Arin MJ，Longley MA，Epstein EH Jr，Rothnagel JA，Roop DR.Identification of a novel mutation in keratin 1 in a family with epidermolytic hyperkeratosis［J］.Exp Dermatol，2000，9(1):16-19.

［18］Starodubtseva NL，Sobolev VV，Soboleva AG，Nikolaev AA，Bruskin SA.［Expression of genes for metalloproteinases(MMP-1，MMP-2，MMP-9，and MMP-12)associated with psoriasis］［J］.Genetika，2011，47(9):1254-1261.

［19］管青，熊志剛，李輝軍.尋常型銀屑病患者血清 MMP-2、IL-18和IL-2的檢測(cè)及臨床意義［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16(7):1183-1185.

［20］Wehkamp K， SchwichtenbergL， Schr9derJM， HarderJ.Pseudomonas aeruginosa-and IL-1beta-mediated induction of human beta-defensin-2 in keratinocytes is controlled by NF-kappaB and AP-1［J］.J Invest Dermatol.，2006，126(1):121-127.

［21］Wehkamp J，Harder J，Wehkamp K，Wehkamp-von Meissner B，Schlee M，Enders C，Sonnenborn U，Nuding S，Bengmark S，F(xiàn)ellermann K，Schr9der JM，Stange EF.NF-kappaB-and AP-1-mediated induction ofhuman beta defensin-2 in intestinal epithelial cells by Escherichia coli Nissle 1917:a novel effect of a probiotic bacterium［J］.Infect Immun，2004，72(10):5750-5758.

［22］郁博，陳德宇，何威.與銀屑病發(fā)病相關(guān)的某些細(xì)胞因子［J］.中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2007，23(8):696-698.

［23］Abdou AG，Hanout HM.Evaluation of survivin and NF-kappaB in psoriasis，an immunohistochemical study［J］.J Cutan Pathol，2008，35(5):445-451.

［24］曹彥明，甄莉.β-防御素-2、IFN-γ 和 NF-κB p65在尋常型銀屑病皮損中表達(dá)的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40(5):80-83.

［25］楊政，文海泉.尋常型銀屑病患者皮膚中誘生型一氧化氮合酶、核因子-κB 65表達(dá)及其臨床意義［J］.中華皮膚科雜志，2001，34(2):103-104.

［26］劉艾林，杜冠華.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué):藥物發(fā)現(xiàn)的新思想［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(12):1472-1477.